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第二篇　细胞的遗传物质 　 第一章　细胞内核酸的提取 人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入，标志着现代医学的发展已逐步进入基因组医学的时代。分子医学核酸是遗传信息以及基因表达的物质基础是重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象它与生命的正常活动，如种族遗传、生长等有密切联系它与生命的异常活动，如肿瘤的发生、放射损伤以及抗癌、抗病毒药物的作用机理也有密切的关系。因此，核酸是重点研究课题之一。核酸分为DNA和RNA两大类。的提取是分子生物学实验技术中基本的操作，　真核细胞基因组DNA的分离与纯化 DNA主要在细胞核内，核外也有少量称为核外基因的线粒体DNA等。真核细胞的DNA分子比原核生物的DNA分子大得多，并且以核蛋白体形式存在于细胞中真核细胞基因组DNA提取的主要步骤裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是去体系中的其它成分，如蛋白质、多糖、脂类及其它不需要的核酸（RNA）等生物大分子的过程。细胞破碎的手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎以及包埋组织的超薄切片等方法。为了获得大量完整的DNA，一般采用等温和的方法破碎细胞。裂解液都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。去污剂是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。盐的作用，提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，抑制核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 。裂解体系中还可加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。根据本身的特征用不同方法。三、DNA提取的实验步骤 （100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）pH8.0，25mmol/L EDTAPBS；TES饱和酚氯仿异戊醇%乙醇溶液70%乙醇溶液TE；0.1%SDS；1μg/ml RNA酶组织块200~1000mg）剪碎后，置入液氮中用冰冷的组织捣碎器捣碎，每100mg组织加入1.2ml消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）500g×5min离心500g×5min离心冰冷的PBS，500g×5min离心，弃上清重复一次用一倍体积的消化液悬细胞移入带盖的离心管中，50℃消化12～18hmin～20min。此时DNA溶液在上层，酚位于下层，中间是变性蛋白层。 7.用吸管小心吸取上层粘稠溶液，移至另一离心管。注意尽量不要带出中间蛋白层。 8. DNA溶液再加等体积15 mo1／L TES饱和酚抽提一次，按6、7离心并吸至另一离心管。 9.加等体积氯仿/异戊醇按步骤（5、6）抽提，离心5min。 10.吸出DNA溶液后，再步骤（9）抽提一次。 11.用吸管将DNA溶液移至Eppendorf中，冰浴至0℃。 12.加2.5倍体积95%冷乙醇震摇，可见DNA白色沉淀析出。 13.用75%冷乙醇清洗3～4次。 14.室温干燥或冷冻干燥DNA。 15.加适量TE溶液溶解DNA。 四、结果鉴定 1．紫外分光光度计检测：可检测DNA的纯度和含量nm时吸光度最大，而蛋白质在280nm时吸光度最大。取2μl DNA溶解液，稀释，紫外分光光度计测定260nm、280nmOD值，计算OD260/OD280比值，比值1.7(2.0:1之间，说明NA纯度可。nm处，1OD双链DNA的浓度为50(g /ml，据此可计算DNA的浓度（(g /ml）=50×(OD260) × 稀释倍数。 2．电泳检测核酸的完整性和大小μl DNA溶解液紫外光下观察，拍照；如果观察到清晰的电泳带，无，说明NA完整性好。 第二节　真核细胞RNA的分离提取 RNA是基因表达产物以下几类分子组成，rRNA（占细胞总RNA的80%～85%）、tRNA和核内小分子RNA（占10～15%）、mRNA（占1～5%）。其中mRNA是分子生物学的主要研究对象分离制备RNA是克隆基因，分析基因表达以及建立cDNA文库的首要步骤。是要获得高纯度的具有充分长度的RNA分子，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的关键是尽量减少RNA酶的污染。RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性的RNA酶外，环境中也存在RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和强力的蛋白质变