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生物学小知识 制作人：郜原 OD (optical density，吸光度) OD260/OD280来判断分子纯度 当OD260/OD280 1.8，表示蛋白质含量较高 当OD260/OD280 2.0，表示RNA含量较高 当OD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA较纯 OD260/OD230 的比值来判断所得到的核酸中的盐和小分子杂质的残留程度 对于核酸纯制品，OD260/OD230应大于2； OD260/OD2302说明去盐不充分 用于细胞转染的质粒大提浓度最好能达到300ng/μL以上 碱基平均分子量324.5。 合成公司交给你的引物成品一般是会注明有几个OD，正常情况下1个OD相当于33μg 。 Tm值的简单计算 蛋白分子量估算 N(氨基酸数量) ×110 Da 增加PCR特异性 镁离子浓度 镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，引物退火，影响PCR产量和特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定； 促进PCR的添加剂 退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution，可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。 RNA提取与验证 RNA完美提出来的话应该是三条带：28s，18s，5.8s； 28s和18s比较亮，而且28s是18s的2倍量，5.8s基本很模糊，可有可无； 28s是5.0kb，18s是1.9kb，5.8s 要小于200kb（人） 质粒电泳图解 细胞培养瓶（板）生长面积容量与细胞数 24孔板长满了细胞大约有3X105个细胞。如果一天后要长到70％（2.1x105），建议放1.2-1.4X105个细胞。 因为细胞刚放进去的前几个小时需要粘在生长表面及适应新的生长条件， 不会达到24小时翻一倍的速度。 大约数目 96孔板 4~5X104 35mm培养皿 1X106 48 孔板 1.3X105 60mm培养皿 2.6X106 24孔板 2.5X105 100mm培养皿 7X106 12孔板 5X 105 150mm培养皿 1.8X107 6孔板 1.2X106 细胞瓶面积 容量 工作体积 细胞数目 12.5cm2 25ml 2ml 5X10 5 25cm2 50ml 5ml 1X10 6 35cm2 75ml 10ml 2X10 6 75 cm2 250ml 15ml 4X 10 6 150cm2 700ml 40ml 1.1X10 7 Kozak sequence Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律，若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下： (1)第4位的偏好碱基为G； (2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T； (3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； (4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基