发酵工程实验讲义-411发工程实验讲义-411发酵工程实验讲义-411发酵工程实验讲义-411.doc

实验三 微生物菌体量的测定 了解测定菌体量的原理，掌握质量法、比浊法和血球计数板法测定液体培养过程中菌体量的实验技术。 微生物菌体量的测定方法可分为基于细胞物理性质变化的直接法和基于细胞内（或外）成分变化换算而得出的间接法。 当微生物以单细胞（无凝聚性）形式生长时，培养基中悬浮粒子数的增加可作为生长菌体量；霉菌、放线菌等以菌丝体形式生长时，菌体量与悬浮粒子间无对应关系。另外，液体培养基中的不溶解成分会影响到菌体量的测定。固体培养中由于培养基颗粒的影响，更多的是采用间接法测定微生物菌体量。 质量法测定酵母菌生物量 实验材料 菌种：酿酒酵母No.30 种子活化培养基：麦芽汁斜面 液体培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，调整pH至5.5。 实验步骤 培养基灭菌：取250ml三角瓶12只，分别加入前面配好的液体培养基70ml，使用12层纱布封口后，于121℃高温灭菌15min，冷却备用。 种子活化和接种：将酿酒酵母No.30接入种子活化培养基，30℃培养24h后，取No.30斜面酵母菌2环，接入装有30ml生理盐水的三角瓶中，充分摇匀。取活化后的酵母种子分别接入已灭菌冷却的12只三角瓶培养基中，每瓶2ml。振荡混匀。 培养：将已接种的三角瓶培养液置于振荡培养箱，200r/min，30℃培养，每隔6h取样2瓶，共取样6次。取得的样品0~5℃冷藏待测。 测定： ①取6cm圆形定性滤纸6张，于80℃烘干至恒重，迅速准确称其质量并记录； ②将每次取得的两瓶样品混合以消除生长不平衡，取其中的100ml用上面称量好的滤纸过滤，并用蒸馏水洗涤滤出物2次； ③将滤纸连同滤出物于80℃烘干至恒重，迅速准确称其质量并记录，滤纸前后质量的差值即为菌体量。 数据处理 将测得数据填入下面表格： 表2-1 质量法测定菌体量 样品编号 1 2 3 4 5 6 滤纸原重/g 滤后重/g 菌体量g/100ml 作图：按测定菌体量的结果，作菌体量X对培养时间t的曲线，即酵母细胞生长曲线。 分析：分析酵母细胞生长曲线的规律，识别静止、对数、稳定、衰亡期等阶段。 浊度法测定酵母菌生物量 1、原理 当白色光通过光孔照射到菌体悬浮液时，会产生光散射和光的透射现象。当利用浊度计测定菌体悬浮液的浊度时，通过测定样品的透射光率和散射光率，可确定菌体悬浮液的相对浓度。 当光通过细胞悬浮液时，入射光的强度为I，透射光通过厚度为h的悬浮介质层后的强度为I0，根据Lambert-Bear经验式， I = I0 e-τh 式中τ——浊度，τ=ρτ 式中——浊度系数 当较大，灵敏度好。但一般培养液的短波段吸收能力较大，为避开这一点，故多使用500-660–淀粉酶及核苷酸酶、内切酶的活性 ↓ 然后再于5min内升温至68℃进行第二段糖化，主要发挥麦芽中a-淀粉酶的催化作用，提高麦汁收率。 ↓ 用碘液检测至醪液不呈蓝色时，再升温至75℃，保温15min，糖化过程结束。（在糖化过程中应注意补水，维持原体积。） ↓ 将醪液用4层纱布过滤，如果醪液不清，返回再过滤，直至麦汁澄清。用糖度计测一道麦汁糖度，用78-80℃热水400ml分2-3次洗糟，洗糟水与滤液混合，测其糖度。 ↓ 添加给0.05g酒花，煮沸30～70min，补水至糖度为10°Bx，趁热用纱布过滤后离心机离心3000rpm,10min，即得到澄清的麦汁。 ↓ 将麦汁分装到250ml三角瓶（装液135ml，每组装2个三角瓶样品），用4～6层纱布及牛皮纸封口，在121℃温度下灭菌20min ↓ 冷却到28～30℃，每组贴上标签备用。 按10%的比例接种酵母菌 ↓ 在28～30℃恒温摇床培养28h，200rpm 在第16h、22h、28h分别取样10ml于试管中，测定发酵液的OD值用。 ↓ 从摇床取出，置于28～30℃培养箱静止培养5天， 在第2、3、4、5天，分别将1个三角瓶发酵液终止发酵置于冰箱中，其中取出10ml测定发酵液的OD值用，取出100ml测定酒精度用；发酵第5天时终止所有三角瓶发酵。 实验五 微生物生长曲线的测定（二） ———酒精度的测定 实验六 糖化酶活力测定 1.定义 1g固体酶粉（或1ml液体酶），于40℃、pH值为4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示。 2.原理 糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液