上转换发光免疫层析试纸条快速定量检测己烯雌酚.docVIP

上转换发光免疫层析试纸条快速定量检测己烯雌酚 　　摘 要 采用溶剂热法合成上转换纳米颗粒（UCNPs）.NaYF4∶Yb，Er，进行表面功能化修饰， 将其与己烯雌酚（DES）单克隆抗体偶联， 制备荧光探针，以牛血清白蛋白.己烯雌酚（BSA.DES）偶联物和羊抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维膜，形成试纸条检测线（T线）和质控线（C线），建立了上转换发光免疫层析试纸条快速定量检测DES的方法。实验结果表明，此试纸条定量检测DES线性范围为25～10000 ng/mL（y=0.43927x-0.57647，R2=0.996）， 检出限为20.84 ng/mL，单个样品检测时间为15 min，批内和批间变异系数均小于10%，特异性识别能力强， 在37℃存放下7天检测值RSD的平均值约为15%。加标回收实验显示平均回收率为90.1%～115.2%，相对标准偏差小于5%，与高效液相色谱法有较好的一致性。 　　关键词 上转换纳米颗粒； 免疫层析试纸条； 己烯雌酚； 定量检测 　　1 引 言 　　己烯雌酚（Dethylstilbestrol， DES）作为一种人工合成的雌激素药物，广泛应用于妇科病的预防和治疗[1]， 同时它还具有促进动物生长和提高饲料转化率等作用[2]。DES可通过食物链进入人体，导致激素分泌异常、甚至乳腺癌和胚胎畸形等严重后果，因此许多国家已明令禁止将DES用于动物养殖[3]。我国国家标准规定的DES检测方法为液相色谱.串联质谱法[4]，目前用于 DES检测的方法主要有酶联免疫分析法[5]、高效液相色谱法[6]、液相色谱.质谱联用法[7]、电化学法[8]、放射免疫法[9]等。以上方法准确灵敏，但存在过程复杂、操作繁琐以及携带不便等缺点。因此，建立简单、灵敏、快速的检测方法十分必要。 　　近年来，基于荧光标记的免疫层析技术得到广泛关注，量子点（Quantum dots， QDs）为免疫层析技术的常用的荧光标记物[10]。 Beloglazova等[11]将QDs作为免疫探针， 建立了检测玉米赤霉烯酮的免疫层析方法， 且灵敏度良好。段宏等[12]利用量子点荧光微球为探针，制备免疫层析试纸条定量检测恶性疟原虫。稀土掺杂上转换纳米颗粒（UCNPs）是一种新型材料，其上转换发光机制源于稀土离子在红外光激发下，可以转化为高能量可见光[13]。NaYF4∶Yb， Er为双掺的上转换稀土化合物，量子产率高，荧光稳定性好[14]。与QDs相比，UCNPs具有稳定性好、亮度高、干扰背景几乎为零、不易光解和光漂白等优点[15]。目前， 上转换发光免疫层析技术的研究逐渐受到关注，於然等[16]将修饰羧基的上转换颗粒用于免疫层析试纸， 检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇，但抗体标记较复杂，检测范围窄。本研究以修饰醛基的UCNPs为载体，将DES单抗直接标记在颗粒表面，制备出新型的荧光探针，建立了上转换免疫层析试纸条快速定量检测DES的新方法。方法检测范围宽，操作简单，适用于大量样品现场检测。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　JEM.100CXII透射电子显微镜（日本电子株式会社）；FTS6000傅里叶红外光谱仪（美国Bio.Rad公司）； LGJ.10D型冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂）； HM3010单维往复划膜仪（上海金标公司）； ZQ2000微电脑自动斩切机（上海金标公司）； 硝酸纤维素膜（NC膜）、加样垫、结合垫、吸水垫、PVC底板及UPT.3A便携式上转换发光免疫分析仪，均由北京热景生物技术有限公司提供。 　　氯化钇（YCl3?6H2O）、氯化镱（YbCl3?6H2O）、氯化铒（ErCl3?6H2O）、十八烯（C 18H 36）购于山东西亚化学工业有限公司；四乙氧基硅烷（TEOS）、3.氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），牛血清白蛋白（BSA）购于上海Sigma公司；己烯雌酚（DES）、雌二醇（E2）、己烷雌酚（HEX）、双烯雌酚（DIEN）、双酚A（BPA）购于北京百灵威公司；己烯雌酚单克隆抗体（DES.ab）、己烯雌酚抗原（DES.BSA）本实验室制备； 羊抗鼠抗体（北京索莱宝公司）； 实验用水为超纯水（18.2 MΩ cm）；其它试剂均为分析纯。牛奶样品购于当地超市。 　　2.2 上转换纳米材料NaYF4∶Yb， Er的合成与表面修饰 　　根据文献[17，18＼]的方法并加以改进。称取0.18 mmol YbCl3?6H2O，0.80 mmol YCl3?7H2O和0.02 mmol ErCl3?6H2O，加入10 mL C 18H 34O2和30 mL C 18H 36。将溶液加热至160℃并维持30 min，形成均匀溶液，同时除去O2和水，然后冷却至50℃。逐滴加入20 mL溶有5 mmol NaOH和8