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PCR技术 2 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的反应体系 引物 DNA聚合酶 模板 dNTP Mg2+浓度 其它 一、引物（primers) 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 引物设计原则 （1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-30 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。 引物设计需要考虑的因素 引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物长度 一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。 碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60% GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性 GC含量太高也易于引发非特异扩增。 引物Tm值 一般要求：55℃-65℃。 计算： 对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15　　 引物二级结构 引物二聚体 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补 发夹结构 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。 引物3’端 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。 引物5’端 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5’端引入标记信号 引物设计软件 Primer Premier 5.0 Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer 简并引物 有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸的遗传密码不只一种，由氨基酸序列反推DNA序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。 嵌套引物 利用第一轮PCR扩增产物作为第 二轮PCR扩增的起始材料，同时除使用第一轮的一对特异引物之外，另加一至 两个同模板DNA结合位点是处在头两个引物之间的新引物。在第二轮扩增产物中， 含有能够同这一组多引物杂交的错误扩增产物的可能性是极低的，所以应用嵌套引 物技术能够使靶DNA序列得到有效的选择性扩增。 引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 二、DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶热稳定性及最适温度 Taq DNA聚合酶的功能 Taq DNA聚合酶激活剂与抑制剂 其他耐热DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 具有5`-3`的聚合酶活力 具有5`-3`的外切核酸酶活力 不具有3`-5`的外切核酸酶活力 激活剂 Mg2+ KCl(50mM) 抑制剂 DMSO、氯化氨、乙酸氨 不同耐热聚合酶的比较 Taq：扩增效率最高的耐热DNA聚合酶，能很好的扩增6kb以下的DNA片段。扩增碱基出错率为10-5左右。 Pfu：目前保真度最高的耐热DNA聚合酶，碱