基于石英毛细管载体的血清甲胎蛋白灰度分析免疫检测法.docVIP

基于石英毛细管载体的血清甲胎蛋白灰度分析免疫检测法 　　摘 要 以熔融石英毛细管为免疫分析载体材料， 以肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP）为模型蛋白， 将AFP捕获抗体固定于毛细管， AFP和AFP的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体分别注入毛细管进行孵育， 形成双抗体夹心结构。注入化学发光底物液后， HRP催化底物液发光， 产生的光信号通过成像仪转化为图片。对图片进行灰度值分析， 建立了血清甲胎蛋白的定量免疫分析检测法。当捕获抗体稀释倍数为100， 酶标抗体稀释倍数为200， 化学发光曝光时间为20 s时， 本方法可在3.1～50 ng/mL浓度范围实现甲胎蛋白测定， 检出限为2.7 ng/mL。对20例人血清临床实际样本进行检测， 结果令人满意， 加标回收率在96.0%～106.7%之间。本方法样本消耗少、材料简单、检测成本低、不依赖大型仪器、 适用性广， 具有较好的临床检验应用前景。 　　关键词 石英毛细管； 甲胎蛋白； 免疫分析； 灰度分析 　　1 引 言 　　随着我国医疗卫生事业的快速发展和人们对健康保健的日益重视， 社会对实用性的检测技术需求越来越多， 体外诊断的新方法、新技术已成为生物分析检测的热点和重点研发方向。目前， 低成本、操作简便、小型化的体外诊断方法和装备的研究正受到科研机构和医疗检测市场的广泛关注。 　　现有的体外诊断产品中， 免疫检测类产品占比很大， 主要采用酶联免疫吸附法、化学发光法、电化学发光法、放射免疫法以及胶体金免疫层析法[1～3]。前两者以微孔板为检测载体， 技术较成熟， 但检测时间较长， 一般需要2～3 h； 电化学发光法主要基于磁珠捕获抗原进行检测， 检测速度快， 一般可在30 min内完成， 但检测成本较高， 约为酶联免疫吸附法的3～4倍； 放射性免疫检测灵敏度高， 但对操作环境及操作人员要求很高； 胶体金免疫层析检测速度快， 可实现现场检测， 但难以实现定量分析。近年来， 一些学者报道了基于纳米材料及微流控技术的新型体外免疫诊断方法， 但纳米材料的制备较难控制其稳定性， 真正实现临床应用的并不多见[4，5]。本课题组多年从事毛细管电泳生物医药分析研究， 所用的分离载体是熔融石英毛细管， 其性质稳定， 透光性好， 表面易进行物理、化学修饰， 加工工艺成熟， 成本低廉[6～10]。本实验将熔融石英毛细管用于免疫检测的载体材料， 研究基于灰度值分析的血清中甲胎蛋白的免疫检测方法， 目的是实现基于石英毛细管材料和灰度分析的定量免疫检测。传统的化学发光免疫分析检测器大多采用光电倍增管， 检测区域有限， 分析速度慢， 而以电感耦合器件（CCD）为代表的图像传感器则可以提供更加广泛的检测区域， 具有光电转换效率高、动态线性范围宽、多通道同时分析等优点， 成为未来生物传感器的一个发展方向[11，12]。实验中使用的便携式化学发光成像仪采用制冷CCD， 灵敏度高， 体积小， 仅有0.006 m3， 能够高效捕获化学发光信号， 形成图片。灰度是指黑白图像中点的颜色深度， 灰度分析法具有结果直观， 分析快速等优点， 在生物学、医学、图像识别领域有广泛的用途[13]， 很多体外诊断试剂的检测应用也采用灰度值分析方法[14]。 　　本研究以熔融石英毛细管为载体， 建立了基于灰度分析的免疫检测方法。以肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP）为模型蛋白， 通过双抗体夹心方式进行检测， 与抗体偶联的辣根过氧化物酶（HRP）催化化学发光底物液发光， 产生的光信号通过成像仪转化为图片[12，15，16]， 进行灰度值分析。研究结果表明， 毛细管免疫检测和灰度分析结合， 实际使用的样本量仅为0.8 μL， 而ELISA检测一般需要50 μL， 因此本方法大幅降低了样本使用量。检测过程中仅需石英毛细管、医用注射器等常用耗材， 操作简单， 不依赖大型仪器。所建方法具有普适性， 可用于基于化学发光免疫分析的生物标志物的快速检测。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂： 　　便携式化学发光成像仪（国家纳米科学中心研制）； 熔融石英毛细管（北京华阳利民仪器有限公司）； 医用注射器（北京科龙生物医学技术有限公司）； 表面活化剂（美国Anteo Technologies公司）； 磷酸盐缓冲液（PBS）和小牛血清白蛋白（BSA）（德国Merck公司）； AFP捕获抗体、AFP的HRP酶标抗体及AFP标准液（北京科跃中楷生物技术有限公司）； 癌胚抗原（CEA）标准液、前列腺特异性抗原（PSA）标准液、糖类抗原125（CA125）标准液及糖类抗原199（CA199）标准液（北京沫之东生物技术有限公司）； 化学发光底物液（美国Millipore公司）； 实验用水由Millipore纯水仪制备。 　　2.2 分析方法 　　2.2