肿瘤家系研究和生物样品库的建立.pptVIP

肿瘤家系研究 --从遗传学到基因组学 自然遗传学杂志刊登了中国科学家撰写的成功精细定位鼻咽癌易感基因的论文，表明中国肿瘤遗传学研究开始进入国际前沿水平，也为中国研究其他肿瘤易感基因定位提供了经验 从遗传学到基因组学 第一阶段 收集临床资料 第二阶段 家庭病史的研究 第三阶段 染色体组型和连锁分析 第四阶段 DNA序列分析 系谱 完整的系谱应有三代以上有关患者及家庭的情况 关键是不可遗漏，死亡者（包括婴儿死亡）须查清死因，是否近亲婚配、有无死胎、流产史，并记录在系谱中。 研究的对象 本研究的对象为核心家系和患病同胞对，核心家系是指一对夫妻及其子女，其中夫妻双方1个为患者另1个为正常人(但可伴其他的非研究疾病)，并且子女中至少有1个患者和1个正常人；患病同胞对是指直系同胞中至少有2个患者及1个正常人 鼻烟癌分子遗传学研究 Genome-wide scan for familialnasopharyngeal carcinoma reveals evidence of linkage to chromosome 4 对32个讲广州方言的鼻烟癌高发家系，进行全基因组扫描和连锁分析、精细定位及单体性分析，将鼻烟癌的遗传易感区定位在4号染色体上，为易感基因的克隆提供了基础 微卫星位点 DNA短串联重复序列(short tandem repeats,STR)即微卫星位点，是一种广泛存在于人类基因组，以2～6个碱基为单位、串联重复排列的序列，多存在于非翻译区及内含子中，其中以(CA)n为最多见。 一般每个微卫星位点有十几个等位片段，具有高度的多态性，并以孟德尔共显性遗传，具有高度的杂合度(heterozygosity,H)和多态信息量(polymorphism information content,PIC)，可以作为一种遗传标记。 通过PCR方法，这些微卫星位点可以广泛运用于精密遗传连锁作图，单基因、多基因遗传疾病的相关基因定位 家系连锁(family-based linkage)分析 人类世代传递时，生殖细胞减数分裂(meiosis)中父方与母方的同源染色体可发生交换/重组(cross-over/recombination)。 染色体上标记位点与疾病位点间发生重组的机率取决于两位点间的距离。 距离越近则在世代传递中重组机率越小，亦即染色体上两个紧密毗邻的位点一起传递给某个子代的机率高于两远隔的位点，此即连锁不平衡(linkage disequilibrium)。 关联及连锁分析均依据此原理来发现与疾病呈连锁不平衡的多态标记，由此确认复杂病易感基因在染色体上的位置 遗传标记物 微卫星标记引物分别标有FAM、HEX、NED三种不同的荧光标记物，在激光扫描下分别显示蓝、绿和黄色，并根据其所扩增片段的大小及荧光标记的不同分成不同的组，每组5至14对引物，分别进行PCR扩增和凝胶电泳 微卫星DNA扩增方法 我们采用多重PCR方法扩增微卫星DNA，PCR反应体系总体积为5 μl，包含50 ng人基因组DNA，10×PCR缓冲液0.5 μl，25 mmol/L MgCl2 0.6 μl，10 mmol/L dNTP 0.1 μl,10 μmol/L引物0.025 μl/对，5 U/μl Taq酶0.05 μl，1.1 μg/μl Taq StartTM抗体0.05 μl，抗体缓冲液〔10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0),50 mmol/L KCl, 50% glycerol〕0.2 μl。PCR反应在96孔薄壁板中进行，PCR仪为Perkin-Elmer-Cetus 9600。 基因扫描和基因分型 　　在0.5 μl PCR反应产物中加入1 μl变性缓冲液(甲酰胺70%，上样缓冲液15%，分子量标记15%)，94℃变性2分钟，立即放入冰浴，取0.6 μl上样液，在ABI 377测序仪上用6%聚丙烯酰胺/7mol/L尿素电泳，电泳条件为电压2500V，电泳时间2.5小时。 含有荧光标记物的电泳条带经ABI 377测序仪激光扫描后将数据存入电脑，经GENESCAN 3.0软件处理后转换成图像文件，再经过GENOTYPER 2.1软件分析后得到每个样本不同位点的基因型结果。 连锁分析 　将每个样本不同位点的基因型结果按其在染色体上的位置依次排列，并结合其表型做成数据文件，通过SUN工作站上的GENEHUNTER(Version 2)分析软件进行连锁分析。 结果 Our findings provide evidence of a major susceptibility locus for NPC on chromosome 4 in a s