封闭及一抗问题一.封闭，一抗.pptVIP

Western blot 实验技术 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 Western实验是一项连贯的有多个步骤的实验技术，在实验过程中会遇到很多的问题，每一个环节出现问题都可能导致最后结果的失败。 实验流程 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色 蛋白提取 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 细胞和组织的处理 问题一. RIPA裂解液裂解细胞，离心后，还有很多粘稠物质 ？ RIPA裂解细胞后的粘稠物质主要是DNA，10000rpm以上离心五分钟就可以沉淀， 取上清液。如果一次离心后还有粘稠可重复一次。 细胞和组织的处理 问题二.组织应该如何裂解最合适？ 1、对于有韧性的组织比如血管，神经等，不能选用玻璃匀浆器，可以选择手动匀浆器和液氮研磨 2、对于一般较柔软的组织比如脑，肝脏等，使用上述三种方法均可。 细胞和组织的处理 问题三.液氮研磨后离心样本不能分层 研磨的时候不充分，会形成絮状的液态物质，如有手动匀浆器可以再进行处理 注意： 裂解时抑制剂的添加非常重要，做一般的蛋白加入PMSF即可，个别蛋白需要加Aprotinin， Leupeptin