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光照还原或化学还原 FAD 泛素化降解 致谢 * 首先介绍一下研究的背景。中波紫外线UVB和短波紫外线UVC会导致DNA上出现损伤。主要有两种损伤类型，其中一种是环丁烷嘧啶二聚体，简称CPD；另一种是6-4光产物。这两种损伤都会抑制DNA的转录和复制，从而对细胞造成毒性。 * 光修复酶是一类在很多物种体内存在的蛋白。其可以利用光能修复DNA上的紫外损伤。根据作用底物，光修复酶可以分为两大类，即CPD光修复酶和6-4光修复酶，分别可以修复CPD损伤和6-4光产物损伤。两类光修复酶的作用机制类似，它们都含有还原型的FAD辅酶。通过天线色素吸收光能将能量传递给FAD辅酶，或者FAD辅酶直接吸收光能，生成激发态FAD辅酶，然后激发态FAD辅酶传递一个电子给损伤底物，损伤底物得到电子后裂解，恢复原来的构象，然后电子再回传给FAD辅酶，完成整个催化修复过程。 * 在对植物的研究中，人们发现了一种与光修复酶高度同源，但不具有光修复活性的蛋白。其可以作为蓝光受体参与调控植物的生长发育和光形态建成。后来人们将其命名为隐花色素。植物隐色素可以和一些蛋白，如COP1,SPA,CIB等相互作用，通过激活一些转录因子或通过调节转录因子的泛素化降解，来调节基因的表达，从而调控植物胚轴的延长、叶片的伸展、花青素的积累以及开花时间等。模式生物拟南芥中存在两种隐色素Cry1和Cry2，其中Cry1在光照下稳定，而Cry2在光照下不稳定。 * 在对果蝇的生物钟研究中，人们也发现了另一种光修复酶的同源蛋白，其也不具有光修复活性，但可以作为光受体参与生物钟的校准，人们也把这种蛋白命名为隐色素。其作用机制是，在光照条件下，果蝇隐色素和另一种生物钟蛋白TIM相互作用，促进其通过泛素化途径降解。此外果蝇隐色素本身在光照条件下也不稳定，也会通过泛素化途径降解。通过这两种机制共同作用，从而校准生物钟。 * 在对哺乳动物生物钟的研究中，人们也发现了一类光修复酶的同源蛋白参与生物钟的调节，这类蛋白也被称为隐色素。但与果蝇隐色素不同的是，哺乳动物隐色素是作为核心组件参与生物钟的调控，其作用可能并不依赖光照。在细胞内，哺乳动物隐色素可以和生物钟蛋白PER相互作用形成复合体，进而抑制生物钟转录因子CLOCK和BMAL1的转录激活作用，抑制包括隐色素和PER等生物钟基因的转录，从而形成一个反馈回路，调节哺乳动物的生物钟。 * 在另外一些研究中，人们也发现了一些光修复酶同时具有类似隐色素的基因表达调控功能。如在真菌构巢曲霉中的CryA蛋白……。植物病原体玉米灰斑尾胞菌……。真核藻类三角褐指藻和青绿藻中的……。……这表明光修复酶和隐色素之间的界限可能并非十分明确。 * 虽然光修复酶和隐色素功能差别较大，但……发挥作用，因此我们可以将它们统称为隐色素光修复酶家族，简称CPF。 * 对CPF家族蛋白的分类有很多方法。通过系统发生分析，可将CPF家族分为六大类，即CPD I，CPD III，DASH蛋白，6-4光修复酶，CPD II，以及最近发现的FeS-BCP蛋白。我们之前提到的植物隐色素和动物隐色素并没有形成单独的分类，而是分别包含在CPD III和6-4光修复酶分类中。这说明两种隐色素的进化起源是不同的，这是一种重复进化的例子，即功能相近的蛋白在进化过程中重复出现。最近发现的FeS-BCP蛋白可能具有修复6-4光产物的能力，可能是原核生物中的6-4光修复酶。大部分FeS-BCP蛋白还可能含有其他CFP家族蛋白中没有的铁硫中心。一般铁硫中心会出现于较原始的蛋白中，因此FeS-BCP蛋白应该是一类较原始的蛋白，可能是CPF家族的共同祖先。 * 我们得到的分析结果和现有报道的结果类似。但我们在分析中发现了CPF家族的两个新的分支，即GIHY蛋白和SPL/MPL蛋白，这是我们的一个新的发现。 * 第三部分我们研究了E. coli光修复酶A377位突变对其光照稳定性的影响。下图左边是FAD辅酶的结构，其主要的功能基团是异咯嗪环，异咯嗪环可以分为三个环，分别是二甲苯环、吡嗪环和嘧啶环。如图所示的异咯嗪环朝向外的面叫做si面，朝内的面较re面。右边是大肠杆菌光修复酶FAD辅酶异咯嗪环附近的残基，其中A377位残基位于异咯嗪环si面嘧啶环的上方，而G381位位于二甲苯环的上方。N378位位于N5位的对面。 * 我们根据对CPF家族的系统发生分析，统计了在A377位同源位点的氨基酸分布。结果我们发现A377位在光修复酶和隐色素中的分布有明显的差异，在可能以CPD为底物的蛋白中，出现A、S、N的比例较高，而在6-4光修复酶和动物隐色素中，出现I、L、V的比例较高。其中有些6-4光修复酶在文献中报道在光照时会出现光致氧化。而动物隐色素中的果蝇隐色素是光照不稳定的。在植物隐色素中有些特殊，有一大半出现的是S，而一小