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非生物胁迫对拟南芥IQM4基因表达的影响 　　【摘 要】本文首先以拟南芥IQM4基因为搜索对象，检索了两个生物信息数据库，搜索到IQM4基因对几种非生物胁迫均能产生应答，并对IQM4基因表达量进行了分析；然后参考数据库所提供的实验方法，采用半定量RT-RCR技术验证了几种非生物胁迫对IQM4基因表达的影响。结果表明盐和渗透胁迫均能抑制幼苗期IQM4基因表达，而脱水、低温和机械损伤早期能增强IQM4基因表达水平。实验初步证明拟南芥IQM4基因在植物非生物胁迫中发挥重要作用。 　　【关键词】拟南芥；IQM4；非生物胁迫；基因表达 　　在植物信号转导途径中，Ca2+作为动植物细胞内重要的第二信使，通过Ca2+传感蛋白及其靶蛋白来调节多种生化和细胞反应。钙调素（Calmodulin，CaM）是目前最重要的一类胞内Ca2+信号受体。在众多的CaMs中，除CaM7具有转录调控活性外，其它均无任何酶活性，必需与其下游的靶蛋白―钙调素结合蛋白（calmodulin-binding protein， CaMBP）来调节细胞生理功能[1]。 　　植物中有5个含IQ基序的钙调素结合蛋白家族：IQM、Myosin、CNGC、IQD和CAMTA，其中IQM家族由我们发现[2]。拟南芥IQM家族共有6个成员，均含1个IQ基序，N-端具有与豌豆重金属诱导蛋白6A的同源序列，C-端具有与天花粉素的同源序列。IQM1编码1个Ca2+不依赖型的CaMBP，影响保卫细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，在气孔运动中发挥重要作用，IQM1缺失抑制了光诱导的气孔张开，iqm1突变体表现气孔开度小和根较短的表型[3]；IQM1过表达株系则表现为气孔开度大和根较长[4]。IQM4（编号为At2g26190）是IQM家族中与IQM1高度同源的成员[5]，其功能未见报道。为了研究IQM4的基因功能，本文以IQM4基因为搜索对象，检索了两个生物资源信息数据库，搜索到IQM4基因对几种非生物胁迫均能产生应答；为了验证生物信息数据库中IQM4基因表达的数据，本文开展了盐、甘露醇、脱水、低温以及损伤处理对IQM4基因表达影响的分析，该研究结果为进一步开展IQM4基因的功能研究提供重要理论依据。 　　1 实验材料 　　实验所用的拟南芥（Arabidopsis thaliana）为Columbia（Col）生态型。MS盐购自Sigma公司，PrimeScript One Step RT-PCR Kit，RNAiso Plus购自TaKaRa公司，NaCl和Manntiol试剂购于上海生工。 　　2 实验方法 　　2.1 拟南芥培养 　　土壤培养：将经过4℃浸泡3d的吸涨种子直接点种于营养土表面，置于长日照培养室中培养（温度为22±2℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为100μmol?m-2?s-1，相对湿度为85%，下同）。 　　1/2MS培养基培养：取经过4℃浸泡3d的吸涨种子，用75%乙醇浸泡5～10s后弃乙醇，再加入0.1% HgCl2浸泡5min后弃HgCl2，用无菌水漂洗3～4次。最后加入适量的0.3% Agar溶液悬浮，接种到1/2MS培养基上，置于长日照培养室中培养。 　　2.2 生物信息学数据库的检索 　　以IQM4基因为搜索对象，检索AtGenExpress Visualization Tool（http：//jsp.weigelworld.or）和Genevestigator Expression Data（https：//），以基因表达改变量为1.5倍为阈值，筛选对IQM4基因表达影响较大的非生物因素作为后续实验的依据。 　　2.3 非生物胁迫的处理 　　渗透胁迫处理：将1/2 MS固体培养基上生长2周的幼苗小心拔出，需保持幼苗的根的完整性，称取30～50mg幼苗为一个样品，共称取6个样品；将样品浸没于300mmol/L甘露醇溶液中，分别在0.5、1、3、6、12和24h取样。 　　盐胁迫处理：称取6个2周幼苗样品，将样品浸没于150mmol/L氯化钠溶液中，分别在0.5、1、3、6、12和24h取样。 　　低温处理：称取3个2周幼苗样品；将样品置于4℃处理，分别在0.5、1和3h取样。 　　脱水处理：称取3个2周幼苗样品；将样品放在滤纸上，并置于长日照培养室中，分别在0.5、1和3h取样。 　　损伤处理：先用带有锯齿的镊子夹伤生长在培养基上的2周幼苗，然后置于长日照培养室中，分别在0.25和0.3h取样。 　　2.4 IQM4基因的RT-PCR分析 　　参照RNAiso Plus说明书提取非生物胁迫处理的样品总RNA。 　　以IQM4编码序列的特异引物F1：5’-AGT