硝化呋喃系代谢物质（SEM，AHD，AMOZ，AOZ）试验法.docVIP

硝化呋喃类代谢物质（SEM，AHD，AMOZ，AOZ）试验法 * 定量法的原理 试验中用盐酸溶液处理呋喃唑酮、呋喃它酮、硝化甘油及硝化呋喃妥因的代谢物质后，用安息香醛（2-NBA）衍生化后，再用醋酸盐萃取，浓缩后进行分析。 测量仪器 液体色谱/质量分析仪 标准品 标准品 Semicarbazize(SEM) 1-aminohydantoin(AHD) 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone(AMOZ) 3-amino-2- oxazolidinone(AOZ) 内标物标准品 3-amino-2- oxazolidinone-D4 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone-D5(AMOZ-D5)  标准试液调剂 标准原液： 硝化呋喃类的标准品10毫克分别称量后，在甲醇中溶解后使它的浓度达到100微克/毫升后使用。 标准溶液：用甲醇分别使标准原液达到40纳克/毫升，100纳克/毫升浓度后，作为标准溶液来使用。 内标物标准原液： 取内部标准品，分别称AOZ-D4，AMOZ-D5 10毫克后，在甲醇中溶解后使其浓度达到100微克/毫升后使用。 内标物标准溶液： 用甲醇稀释内部标准物质标准原液，达到100纳克/毫升浓度后使用。 试液调剂 0．05M衍生化溶液： 2-安息香醛（MW151。12，99%）0.75克，在DMSO100毫升中溶解后作为衍生化溶液使用。 0.125M盐酸：蒸馏水975毫升中加入5M盐酸溶液25毫升混合使用。 0.1M磷酸钾：蒸馏水900毫升中二磷酸钾（K2HPO4，磷酸氢钾，MW174.2 0.8M氢氧化钠: 1M氢氧化钠溶液80毫升中加20毫升混合使用 10mM醋酸胺:蒸馏水900毫升中加醋酸胺(MW)77.08,98%)0.79克溶化后使它成1升后使用 试验溶液的配制 称1克样品,在样品中(A)(填加浓度100纳克/毫升内标物混合溶液50微升,静止15分钟后,加入0.125M盐酸10毫升和0.05M衍生化溶液100微升后在37度的水池中反应16小时.当把衍生化的试验溶液冷却到室温后,加入0.1M磷酸钾溶液10毫升及08M氢氧化钠溶液500微升,调节为约PH7.4左右.为了除掉此试验溶液的殘渣,用4000RPM下进行5分钟离心分离.从离心管中分离出上层液后,加10毫升乙烷混合,并在4000RPM中离心分离5分钟 把下层再放入其它的离心管里.再加醋酸盐7毫升进行混合后在4400RPM下离心分离10分钟取上层液放入玻璃管里.重复这种过程两次, 在氮中浓缩干燥所获得的上层液,在50%甲醇0.5毫升中溶解,15000RPM中离心分离10分钟.0.2微升粘膜过滤上层液后作为试验溶液来使用. 前处理流程图 在50ml离心管中加入1g样品，再加入50ml内标液 静止15分钟 加入0.125M盐酸溶液10ml，0.05M 2NBA溶液100ul 37℃水浴16小时 室温冷却 用10ml 0.1M磷酸钾溶液和500ml 0.8M NaOH溶液调整PH值至7.4 4000rpm离心5分钟后将上清液加入新试管 加10ml乙烷，混匀后，4000rpm离心5分钟 将下层物移入新试管 加入7ml乙酸乙酯，44000rpm离心10分钟 将上清液移入玻璃管，重复2次 在40℃条件下蒸发干燥 用0.5ml甲烷溶液溶解 用0.2um注射过滤器过滤 注入LC/MS或LC/MS/MS 1g sample in 50? centrifuge tube, add 50? internal standard ↓ Let for 15min. ↓ Add 10? 0.125M HCl sol., 100? 0.05M 2-NBA sol. mix gently ↓ Incubate on water bath(37℃ 16hour) ↓ Cool at room temperature ↓ Adjust pH 7.4 adjust with 10? 0.1M potassium phosphate and 500? 0.8M NaOH ↓ Centrifuge at 4,000rpm for 5min and transfer the supernatant into new tube ↓ Add 10? hexane, mix and centrifuge at 4,000rpm for 5min ↓ Transfer the aquatic lower phase into new tube ↓ Add 7? ethyl acetate and centrifu