11第十章 蛋白质课件1.pptVIP

第十章 蛋白质和氨基酸的测定 第一节 概述 第二节 凯氏定氮法 第三节 蛋白质的快速测定法 第四节 氨基酸总量的测定 第五节 个别氨基酸的定量测定 第六节 氨基酸的分离与测定 第一节 概述 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分之一，是生物体发育及修补组织的原料。一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养成分。 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，相对分子量通常为数万至数百万，分子长轴通常为1～l00nm。蛋白质由20种α-氨基酸通过酰胺键结合起来，并具有一定的空间结构。不同的蛋白质，其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质含氮量也不同。一般蛋白质含氮量为16%，即1份氮相当于6.25份蛋白质，此数值(6.25)称为蛋白质换算系数。不同种类的食品蛋白质换算系数有所不同，如玉米为6.24，花生为5.46。 第一节 概述 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质。虽然从各种天然物中分离得到的氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种。在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食物供给，称为必需氨基酸。 不同食品中蛋白质含量各不相同。一般来说，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。 第一节 概述 测定蛋白质的方法通常可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。 由于食品中氨基酸成分复杂，故在常规检验中大多测定样品中的氨基酸总量。色谱技术的发展为各种氨基酸的分离、鉴定及定量提供了有力的工具，利用氨基酸分析仪、高效液相色谱仪等可以快速、准确地测出各类氨基酸含量。下面分别介绍常用的蛋白质和氨基酸测定方法。 第二节 凯氏定氮法 一、常量凯氏定氮法 二、半微量凯氏定氮法 三、自动凯氏定氮法 一、常量凯氏定氮法 （一）原理:样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨游离，用硼酸吸收后再用盐酸或硫酸标准溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。 （二）仪器:常量凯氏定氮消化、蒸馏装置如图。 一、常量凯氏定氮法 （三）操作方法 1.样品消化:准确称取0.2～2.0g固体样品或2.0～5.0g半固体样品或吸取10.0～20.0mL液体样品（约相当于氮30～40mg），移入干燥的500mL凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL浓硫酸，轻轻摇匀，消化至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min。 2.蒸馏:消化液冷却后，加入蒸馏水定容，加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。将凯氏烧瓶按上图蒸馏装置方式连好，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下。通过漏斗加入70～80mL 400g/L氢氧化钠溶液，并摇动凯氏瓶，至瓶内溶液变为深蓝色，或产生黑色沉淀，再加100mL蒸馏水（从漏斗中加入），加热蒸馏，至氨全部蒸出（馏液约250mL即可），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1min，蒸馏完毕，即可停止加热。 一、常量凯氏定氮法 3.滴定及计算：将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸溶液滴至由蓝色变为微红色为终点，记录盐酸溶液用量。同时做全程空白试验（从消化操作开始）。结果按公式计算： 二、半微量凯氏定氮法 （一）原理：同常量凯氏定氮法。 （二）仪器：定氮蒸馏装置如图。 三、自动凯氏定氮法 （一）原理：同常量凯氏定氮法。 （二）仪器：消化装置：红外线加热消化装置；自动凯氏定氮仪：具有自动加碱蒸馏、自动吸收、自动滴定以及数字显示等功能。 （三）操作方法 1.称取0.50g～1.00g样品，置于消化管内，加入硫酸铜、硫酸钾，再加入浓硫酸10mL，将消化管置于红外线消化炉中，用连接管连接密封住消化管，开启抽气装置，开启消化炉的电源，至消化液完全澄清并呈绿色。 2.取出消化管，移装于自动凯氏定氮仪中，自动加水、加碱后，自动蒸馏、滴定，由数显装置即可给出样品总氮百分含量，并记录样品总氮百分比。根据样品的种类选择相应的蛋白质换算系数F，即可得出样品中蛋白质含量。 3.排出废液并清洗消化管。 第三节 蛋白质的快速测定法 一、双缩脲法 二、紫外吸光光度法 三、染料结合法 四、水杨酸吸光光度法 一、双缩脲法 （一）原理：当脲被小心地加热至150－160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），双缩脲在碱性条件下，能与硫酸铜作用生成紫红色配合物，称为双缩脲反应。 由于蛋白质分子中含有肽键