SDS-PAGE原理及结果分析技巧概要.ppt

含量测定 根据有无浓缩效应，分为连续系统和非连续系统。前者电泳体系中缓冲液pH值和凝胶浓度只有一个，带电颗粒在电场作用下依靠电荷和分子筛效应被分离。后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中流动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因此分离条带的清晰度和分辨率均较前者为佳 非变性条件下的凝胶电泳使蛋白质依据其固有特性，如大小、形状和电荷等进行迁移，在对蛋白质的分子量影响最小时，可以对蛋白质的低聚物状态、构象改变、电荷变异以及影响构象或电荷的翻译后修饰的情况进行分析。 * 注意：（1）为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3，loading最高可处理30-40mg/ml蛋白（2）样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10～100mmol/L （3）二硫键是否完全被还原 没有二硫键，非还原/还原电泳图中分子量一致 分子内二硫键，折叠越紧密电泳中跑的越快； 还有少部分分子间二硫键，形成聚体形式。 同一种蛋白形成分子间二硫键，二聚体、三聚体。 蛋白分子可能只有1个半胱氨酸，分子内不能形成二硫键。 同一目的蛋白，上样量大条带宽，分析值偏低。 稳定性考查； 酶切除标签；抗体Fc段 酶稀释液、样品稀释液，组分分析：常见BSA或牛血清、casein 另外，表面活性剂tween、Triton SDS原理及结果分析技巧聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide,Acr）和交联剂N’N’-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）以29:1的比例在聚合剂过硫酸铵(ammonium persulfate，APS)和催化剂TEMED的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。 优点： 凝胶孔径可调节（改变单体和交联剂的浓度），因此可根据被分离物的分子量范围选择合适的浓度 灵敏度可达1mg 分辨率高，可分离大小相差仅3%的多肽。尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体 无电渗作用，只要纯度高，操作条件一致，样品分离重复性好 凝胶透明，有弹性，机械效能好 化学性能稳定，与分离物不发生化学反应; 对pH和温度变化较稳定 PAGE 电泳原理 分子筛效应: 分子大小和形状 电荷效应：大部分的蛋白质在pH8.3电泳缓冲液的条件下带有负电荷，表面负电荷多的蛋白质迁移快，反之则慢 （强阴离子去污剂SDS使蛋白结构松散，并带上大量负电荷，导致本身电荷差别消失，因此SDS分离蛋白主要依赖分子大小，而非电荷或形状） 不连续系统具有对样品的浓缩效应 pH值的不连续 缓冲液离子成分的不连续 电位梯度的不连续 凝胶浓度的不连续以及电压的不连续. 分离胶 (8-15%, pH8.8) 浓缩胶 (5%, pH6.8) 加样 加电场，样品浓缩在界面上 电泳结束 — + 电泳的应用 测定蛋白质分子量（亚基）；结合凝胶过滤层析可用来测定蛋白质的分子量和聚合状态 分析纯度 测定蛋白质的含量 蛋白质水解分析 鉴定修饰（糖基化） 分离纯化 结合Western Blot、免疫共沉淀等方法可用来鉴别蛋白质相互作用 电泳的应用 测定分子量 蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。 注意：①SDS单体的浓度，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3； ②样品缓冲液的离子强度；③二硫键是否完全被还原，许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的分子量；④使用软件分析需要图片调正；⑤上样量少，条带越宽分析偏差（偏小）越大。 测定分子量 非还原/还原蛋白质状态的比较：为什么要用还原性电泳测分子量？ 测定分子量 测定分子量 测定分子量 测定分子量 测定分子量 纯度分析 根据有无浓缩效应，分为连续系统和非连续系统。前者电泳体系中缓冲液pH值和凝胶浓度只有一个，带电颗粒在电场作用下依靠电荷和分子筛效应被分离。后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中流动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因此分离条带的清晰度和分辨率均较前者为佳 非变性条件下的凝胶电泳使蛋白质依据其固有特性，如大小、形状和电荷等进行迁移，在对蛋白质