细胞工程—动物细胞培养细节复习题1.docVIP

动物细胞原代培养-技术细节 1、原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。 2、传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。 3、无菌操作基本技术: 3.1实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。 3.2每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。 3.3实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 3.4无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 3.5实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面中央无菌区域，勿在边缘非无菌区域操作。 3.6小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 3.7工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 3.8定期检测下列项目： ①CO2 钢瓶的CO2 压力②CO2 培养箱的CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 ③无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 4、培养基 4.1 液体培养基贮存于4℃ 冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃ 水槽中温热。 4.2 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间谷氨酰胺可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量谷氨酰胺。 4.3粉末培养基配制(注意)： 细胞培养基通常须添加10 % 血清、pH 为7.2 - 7.4。粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。纯水配制。以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌。标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。须作生长试验与污染测试。 5、抗生素 5.1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素 5.1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。 5.1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，须添加抗生素，待token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。 5.2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个培养瓶时，则须添加抗生素(青霉素100 units/ml + 链霉素100 ug/ml)。 5.3. 若要检测支原体，则培养基内不可添加庆大霉素，因庆大霉素会抑制支原体生长。 6、血清：-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 7. 血清之沈淀物 7.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。 7.2显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，一般而言，此小黑点应不会影响细胞的生长。 8、细胞冷冻保存注意事项： 8.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好且存活率高之状态，约为80 – 90 ％致密度。 8.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 8.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色以5~10 ml 小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。甘油亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 9、