环境微生物学殷士学第10章课件教学.pptVIP

PPT研究院 POWERPOINT ACADEMY 2. Southern印迹(Southern blot) Southern印迹是确定特定DNA序列的方法，因系英国生物学家Edwin Southern于1975年发明而得名。该方法先将DNA经限制性内切酶消化成一系列长度不等的片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳把各片段彼此分开；然后用碱处理凝胶，使DNA的片段变性；中和后，在高盐缓冲液中通过毛细作用在原位将变性后的单链核酸转印到硝酸纤维膜上，烘干、固定；用放射性标记探针进行杂交。 10.3.5　DNA标记序列扩增 1.进化指针序列2.功能基因的序列(Functional gene sequences)3.随机扩增多态性DNA(Randomly amplified polymorphic DNA) 1.进化指针序列 1)该分子必须广泛存在于所有的研究对象中。2)该分子在各个对象中必须具有完全相同的功能，否则就不能比较微生物彼此之间的进化关系。3)该分子的序列在不同物种之间可以比较(Align)。4)该分子序列的变化速度与进化距离之间成对应关系。 2.功能基因的序列(Functional gene sequences) 利用16S rRNA基因序列，可以了解环境样品中微生物种群组成，但是较难将群落结构与功能相关联。系统发生学上极为近似甚至完全相同的两个菌株也不一定具有完全相同的功能。因此，要想了解群落结构与功能之间的关系，有必要研究功能基因。 3.随机扩增多态性DNA(Randomly amplified polymorphic DNA) 随机扩增多态性DNA方法是使用单条短引物(一般为10bp)不针对任何特定基因的扩增方法。引物在低退火温度下与DNA多位点随机结合或错配，并启动DNA的合成(扩增)。扩增产物在凝胶上成特定的特征性分布，反映环境样品中DNA的群落结构及其多样性。该方法用于比较不同样品在某基因成分上的区别是很有用的，且分辨率很高，如验证两个环境样品中是否都存在某一中细菌等。但是由于扩增的随机性，产物的重现性是一个很难解决的问题。很多因素如DNA提取方法、DNA模板与引物的比例、引物合成的批次、PCR条件、PCR仪的型号、Mg2+浓度、Taq酶的来源等都影响扩增产物的重现性，因此一般用经验性方法来获得重现性好的条件。例如用20条引物在各种条件下对同一个环境样品总DNA进行多次重复扩增，得到重现性较好的产物的那条引物及其相应条件被确定为有效引物和有效条件。 10.3.6　基于PCR的微生物群落结构分析技术 1.克隆文库分析方法(Clone library analysis)2.遗传指纹图技术(Genetic fingerprint technology) 1.克隆文库分析方法(Clone library analysis) 图10-17　克隆过程 2.遗传指纹图技术(Genetic fingerprint technology) (1)限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)方法　限制性内切酶(Restriction endonucleases)能识别DNA中某特定的碱基序列(4~6个碱基)，并从这个位置把DNA切断；被切断的DNA位置称为酶切位点。(2)变性梯度凝胶电泳(DGGE)/温度梯度凝胶电泳(TGGE)　变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)和温度梯度凝胶电泳(Temperature Gradient Gel Electrophoresis,TGGE)是两种用来分离相同长度但碱基序序列不同的DNA片段的类似方法，不同的是DGGE用变性剂使DNA变性，TGGE用温度使DNA变性。(3)单链构象多态性(Single-stranded-Conformation Polymorphism,SSCP)　该方法的原理是：在恒定条件下序列不同的单链DNA会以某种方式折叠成不同构象的结构，序列相同的单链DNA形成相同的构象；不同构象的DNA在电泳中的迁移速率不同，在非变性凝胶中处于不同的位置，从而分开不同碱剂序列的单链DNA片段。 (1)限制性片段长度多态性 图10-18　基因组DNA酶切示意图 (1)限制性片段长度多态性 图10-19　RELP区分菌株变异示意图 (1)限制性片段长度多态性 图10-20　土壤总DNA的16S rDNA片段RELP图谱注：16S rDNA片段长度为1.3kb；8个克隆分布于不同泳道；两边2个泳道为DNA片段长度标尺；内切酶为Rsa I。 (1)限制性片段长度多态性 图10-21　T-RFLP方法和结果a)T-RFLP方法　b)结果