TdT加尾反应及其替代反应.ppt

快速扩增cDNA末端——RACE RACE的基本概念 不同厂家RACE试剂盒的介绍 RACE技术的关键环节 存在的问题及解决办法 RACE的基本概念 cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为Frohman在1985年首次报道。 3’RACE 和5’RACE 3’RACE原理示意图 mRNA (A)n 5’ GSP 3’ 5’ 3’CC…CC GSP2 GI … IG 5’ AAP AUAP nested GSP 3’ CC…CC 5’ GI … IG 5’ 3’ 3’ AUAP nested GSP 5’ 3’ 5’ (A)n 5’ 不同厂家RACE试剂盒的介绍 Invitrogen GeneRacerTM Kit BD SMARTTM RACE RACE技术的关键环节 RACE 技术的关键环节有2个： 1. 3个连续的酶促反应 （逆转录、TdT加尾、PCR扩增） TdT加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）催化，它可将dT依次加在寡核苷酸的3’端 2. RACE的引物 即使3个酶促反应均平稳顺利进行，但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物背景。 存在的问题及解决办法 反转录 RNA的质量 有高质量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至关重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作没有结果既浪费时间又浪费试剂，给试验带来麻烦。 反转录提前终止 模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反转录过程中一直保持已变性的RNA模板处于50℃以上，避免以解开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5’末端。 提供一种改进的反转录方法 在RNase-free的0.2 mL Eppendorf 管中加入以下成分： Oligo(dT)(0.5μg) 1μL Total RNA(4~5μg) 3μL DEPC-H2O To 25 μL 混匀，70℃保温10min；50℃保温5min；稍微离心一下。 在混合物中，依次加入以下成份： 10X SSⅡ（ SSⅢ ）Buffer 5.0μL 10mM dNTP mix 1.0μL 0.1M DTT 2.0μL RNase Inhibitor(40U/μL) 1.0μL DEPC-H2O To 24 μL 轻轻混合，在50℃保温5min后，在50℃下将3号管中的混合成分移入2号管中。 每个反应加入1μL SuperScriptTM Ⅱ（SSⅢ ），轻轻混匀，50℃反应50min。 70℃放置15min以终止反应。 -20℃保存。 TdT加尾反应及其替代反应 首先在反转录后，一些无用的核苷酸和过多的cDNA引物的存在会干涉加尾的成功，降低目的cDNA加尾的有效性，从而导致第二链cDNA合成效率的降低。 其次，TdT反应难以控制，所有的cDNA都被加尾，而不管是否是全长cDNA，这样产生的非全长的cDNA将和全长产物一起完成PCR反应，而且会优先扩增，不能保证在PCR反应中有足够的全长产物能被探测。 TdT加尾反应及其替代反应 第三，若目的cDNA中含有与多聚尾互补的几个核苷酸同聚区，则在合成第二条cDNA链时引物的延伸会从内部序列而不是末端序列开始，产生非全长的第二条cDNA链。 我们所使用Invitron公司的RACE试剂盒，采用PCR介导的连接反应，在一定程度上避免了以上的问题。 RACE试剂盒中末端转移的是多聚C尾，这样在反转录合成第一链时5’端多聚G的二级结构影响反转录的彻底进行，会产生提前终止反应。我们改进了加尾的程序，用TdT酶加上多聚T尾，结果降低了反转录的难度，两个基因最终均获得了完整的5’末端。 RACE引物的设计 在实验过程中总结如下经验： 引物不能设计在保守区简并引物区。 各引物之间尽量不要重叠，由于引物的重叠，会引起很严重的引物多联体现象，不能准确地扩增。 尽量多设计引物，以减少PCR扩增的非特异性。也可以考虑在PCR鉴定阳性克隆的时候另设计一对引物，便于鉴定的正