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开　题 报　告 大鼠骨髓间充质干细胞分化为 心肌样细胞的体外诱导实验 研究生：郭 燕 导　师： 赵凤琴 专　 业：心 内 科 主 要 内 容 2 3 1 3 3 3 5 4 可能遇到的问题及解决方法 可行性分析 3 7 3 9 8 研究概况 选题目的及临床意义 实验材料与方法 实验进度 预期结果 统计分析 经费预算 6 研究概况 ☆近年来，心血管疾病的细胞治疗日益成为研究热点，自体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植是用于心肌修复的细胞来源之一。一般认为出生后心肌细胞再生能力极弱，一旦损伤只能由瘢痕替代，最终导致心衰。MSCs因取材方便，具有多向分化潜能和较强的增殖能力而倍受关注。因此，探索体外培养自体心肌样细胞的方法和条件，将为MSCs的深入研究和临床应用奠定基础。 研究概况 ☆ 1995年Wakitani等发现大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可被5-氮胞苷(5-azacytidine)体外诱导分化为心肌样细胞，在1999年，Makino等从小鼠股骨中获得MSCs，通过5-氮胞苷(5-aza)诱导，这些细胞表达了特异性的心房利钠多肽、脑钠素，电镜下显示有典型肌小节、心房组织颗粒等心肌样超微结构，电生理检测有类窦房结及类心室细胞的动作电位。 研究概况 ☆现阶段对MSCs经诱导分化为心肌样细胞的实验研究大多数集中在对诱导剂适宜浓度的探讨摸索和寻求更多不同种类诱导剂的阶段，探求一种公认有效便捷的诱导培养方法成为各国科研人员的研究热点。 研究概况 ★骨髓间充质干细胞的生物特性 BMSCs来源于中胚层，存在于全身结缔组织和器官间质中，是有跨胚层分化潜能的成体干细胞，在骨髓中含量最丰富。具体有以下特性： 自我更新能力：通过不对称分裂一方面实现增殖与分化，另一方面维持自身干细胞数量的稳定。 研究概况 ☆骨髓间充质干细胞的生物特性 多向分化能力：具有广泛的分化潜能，既往大量实验证实，在合适分化条件下不仅可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞等，而且可以跨胚层分化为外胚层的神经元、神经胶质细胞和内胚层的肝细胞、内皮细胞、心肌细胞。 形态和生长方式：在形态上呈现为成纤维样和不规则形，胞浆丰富、核染色质细、核仁明显，平行排列或螺旋样生长。在体外具有很强的增殖能力，可以在体外大量扩增和长期培养，并且可以长时间保持其分化状态。 研究概况 ◎骨髓间充质干细胞的生物特性 免疫表型：目前就其特异性标志物尚无统一意见，但多数学者认为BMSCs表达CD166，CD105，CD102，CD90，CD54，CD5O、CD49、CD44、CD29、SH2、SH3、IL-6、IL-7、IL-8，IL-11、IL-12、IL-14、SCF、G-CSF、GM-CSF等。不表达细胞表面抗原CD14、CD31、CD34、CD45、CD117、CD133和主要组织相容性复合分子，如HLA-DR。 研究概况 ☆5-氮胞苷在骨髓MSCs分化为心肌细胞中的作用 5-氮胞苷(5-azacytidine)是一个细胞因子，为胞嘧啶核甙的一个类似物，可引起DNA中某些胞嘧啶低甲基化，从而参与激活表型特异性基因，促进定向分化。骨髓MSCs携带着决定肌细胞表达的基因座，但在磷酸化状态下，转录不能被激活。用5-氮胞苷去磷酸化，转录激活，骨髓MSCs分化为心肌细胞。 选题目的 ★本研究通过5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells，rMSCs)分化为心肌样细胞的体外实验，探讨其诱导分化影响因素(如诱导剂浓度、细胞外钙离子浓度、培养条件)，从而确定一种合适的诱导方式，为进一步的临床基础和应用研究提供基础理论。 选题临床意义及创新 近年来有关骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的文献报道已不少见，但是MSCs的体外分化能力尚存在争议。到目前为止有关rMSCs分化为心肌样细胞过程中影响因素的报道还不多，且尚无统一定论。本实验研究体外不同条件下rMSCs向心肌细胞诱导分化潜能及其影响因素，为干细胞分化为心肌细胞的方法学提供实验依据，以期为干细胞移植治疗心肌梗死、心力衰竭等疾病提供更加良好的细胞源。 实验材料与方法 实验动物 4w龄SD大鼠若干只（由辽宁医学院动物实验中心提供，SPF级，雄性，体重约100g），试验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。 主要试剂 DMEM培养基(低糖) 美国Gibico公司 胎牛血清(FBS) 美国Gibico公司