基因编辑简介解剖.pdf

何小柏 江苏科技大学 基因编辑主要技术 ? ?ZFN （锌指核酸酶） ?TALEN ?CRISPR/CAS9 一、ZFN技术 ? ? 锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN） 是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌 指结构识别特异DNA序列，再通过核酸酶切断靶 DNA。研究者可以通过加工改造ZFN 的锌指DNA结 合域，靶向定位于不同的DNA序列，从而使得 ZFN可以结合复杂基因组中的目的序列，并由 DNA切割域进行特异性切割。 ? ? ? 1.ZFN的结构 ? ?ZFN=锌指DNA结合域+DNA切割域 锌指DNA结合域部分一般包含3个独立的 锌指（Zinc finger, ZF）重复结构， 每个锌指结构能够识别3个碱基，因而 一个锌指DNA结合域可以识别9bp长度的 特异性序列（而ZFN二聚体，则包含6个 锌指，可以识别18bp长度的特异性序 列）。目前最常用的ZF结构为Cys2His2 锌指，其结构由大约30个氨基酸包裹一 个锌原子构成。 1.ZFN的结构 ? ?ZFN中应用最广泛的DNA切割域来自IIS型限制性内切酶 FokI。由于切割域与DNA链的结合能力较弱，因此DNA 切割域必须以二聚体的形式发挥作用。 ? ? 2.ZFN技术的机制 ? ?非同源末端链接（non-homologous end joining, NHEJ ） ?同源重组（homologous recombination, HR ） 2.ZFN技术的机制 ? 2.ZFN技术的机制 ? 3.ZFN 技术的应用 ? ZFN技术具有重大的应用价值。在科研和农业领域， 该技术既可用于基因的敲除失活，也可用于导入目标基因， 使基因激活或阻断，或者人为改造基因序列，使之符合人 们的要求。在医疗领域，经ZFN技术改造后导入治疗性基 因的质粒或干细胞可被导入人体，实现基因治疗。此外， ZFN技术也可以直接用于有害基因的修补替换或是直接删 除，以达到相关治疗目的。ZFN技术具有极佳的特异性和 效率，因此能将基因/基因组错误修改的风险降到最低。 从理论上来说，研究人员甚至可以在任何物种中，对处于 任意生长时期的细胞进行ZFN操作，可以自如地修改其基 因，而还不破坏细胞状态。 3.ZFN 技术的应用 ? 使用ZFN技术切割CCR5受体的编码序列，以破坏CCR5膜受体的功 能，使HIV失去细胞感染能力。 3.ZFN 技术的应用 ? 使用ZFN技术进行基因组编辑，插入小段序列将Dystrophin基因的读 码框恢复正常。 3.ZFN 技术的应用 ? 使用ZFN插入HSV的TK基因，直接造成一条21号染色体自发丢失；使 用ZFN在一条21号染色体上插入Xist基因，使这整个染色体失去功能。 4.ZFN 技术的缺陷 ? ?脱靶效应：ZFN剪切的过程并不完全依赖同源