专题5_2_多聚酶链式反应扩增DNA片断讲课.ppt

* * 专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片断 ★分子生物学研究中最强大的实验技术之一 ★其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程 美国科学家　穆利斯(K.B.Mullis) 发明了PCR技术　1993年诺贝尔奖 ㈠.DNA分子的结构 C、H、O、N、P 1.元素组成： 脱氧核苷酸 2.基本单位: 一.基础知识 脱氧核苷酸 磷酸 脱氧核糖 含氮碱基 嘌呤 嘧啶 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T） 一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端 3.多脱氧核苷酸链得形成 多脱氧核苷酸链结构简图 4.DNA分子的双螺旋结构 ⑴.DNA分子是由 的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。 ⑵. 与 交替连结，排列在外侧，构成基本骨架； 排列在链的内侧。 ⑶.两条链上的碱基通过 连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与 配对， 一定同胞嘧啶配对。 双螺旋 两条反向平行 脱氧核糖 磷酸 碱基 氢键 胸腺嘧啶 鸟嘌呤 ㈡.DNA的复制 2.时期 有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。 3.场所 细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。 1.概念 由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。 4.基本条件 酶:解旋酶、DNA聚合酶 能量:ATP 原料:四种脱氧核苷酸 模板:DNA的两条链 ⑴.边解旋边复制(过程） 5.复制特点 ⑵.半保留复制（结果） 6.遵循原则： 碱基互补配对原则 7.精确复制的原因 8.复制的意义 DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性 ⑴规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板 ⑵碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 总结：胞内DNA复制的基本体系 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 ㈢.PCR(多聚酶链式反应） 2.DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。 3.DNA聚合酶作用过程 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 1.定义： 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 4.PCR原理 ⑴.在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。 ⑵.当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。 ⑶.PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。 5.Taq DNA聚合酶的应用 6.需要为PCR反应提供的物质 缓冲液、DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、 简便、重复性好、易自动化等突出。 7.PCR技术的特点： 8.细胞内和细胞外DNA复制环境的区别 体内DNA的复制 PCR 模板(母链) 引物 原料:dNTP 聚合酶 反应环境 细胞内源 引物合成酶 细胞内的环境 细胞内源 细胞内源 外源加入 缓冲液 外源加入 外源加入 外源加入 ⑴.PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸 9.细胞内复制和PCR不同点 ⑵.PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 10.PCR的重要应用： 广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。 1、PCR仪 ㈠.设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器。 二.PCR的实验操作 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为