组织培养第十二章讲课.ppt

第十二章 种质离体保存 种质是指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。 种质保存（germ plasm conservation）：指利用天然或人工创造的适宜环境来保存种质资源，使个体中所含有的遗传物质保存其遗传完整性（genetic integrity），有高的活力（vigor），能通过繁殖将其遗传特性传递下去。 传统保存方法有种子保存和种植保存。 种质保存方式：原地保存和异地保存。 前者通过建立自然保护区和天然公园里实现，后者通过植物园、种质园、种子库及离体保存来实现。 种子保存的优点 占用空间小； 可以保存多年； 种子容易干燥和包装，便于运送到引种中心和基因库 种子保存的缺点 1）随着贮存时间的延长，种子的生活力逐渐下降，并常常受到病虫害的侵袭； 2）种子一般都是杂合体，繁殖中性状会分离而不稳定，因而除了无融合生殖物种以外，难以保存各种来源不同的无性系； 3）不适用于营养繁殖作物； 4）在苗圃或田间大量保存各种植物基因型，不但成本极高，而且还有受到天灾毁灭的危险。 离体保存的优点： 1、解决一些无性繁殖作物种质资源在低温下长期保存问题，可有效避免资源的丢失。 2、节省土地和劳动力，保存方法简单，花费少，且能在保存中脱毒。 3、在提供利用时，可快速繁殖，也有利于国际国内种质交换。 离体保存的一个基本要求是把继代的次数减少到最低限度。 一、超低温保存 超低温保存（ultra-low temperature）：一般是-196℃（液氮）的超低温下使保存的活细胞的物质代谢和生长活动几乎完全停止，在适宜的条件下可迅速繁殖，生出新的植株，并保持原来的遗传特性。 1.植物超低温保存的概念及意义 优点： 1）长期保持种质遗传性的稳定； 2）保持培养细胞形态发生的能力； 3）保存稀有珍贵及濒危植物的种质资源； 4）保存不稳定性的培养物，如单细胞； 5）长期贮存去病毒的种质； 6）防止种质衰老； 7）延长花粉寿命，解决不同开花期和异地植物杂交上的困难； 8）便于国际间的种质交换； 9）经过超低温保存后的再生植株，有可能产生高抗寒性的新材料； 10）用于超低温保存的设备较简单，不需要大量的基本建设投资 2.超低温保存的原理 超低温保存时，降温冷冻和化冻过程最易引起植物材料的伤害。 在降温冷冻过程中，植物遭受冻害的原因：1）细胞内部结冰；2）细胞内溶质的浓缩。 因此在降温冷冻过程中创造适宜的条件，使植物材料发生保护性脱水。 防冻剂在低温下对植物起保护作用的原因 1）在溶液中产生强烈的水合作用，提高溶液的黏滞性，从而可在温度下降的同时降低冰晶形成和增长的速度； 2）增加细胞膜透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，从而防止细胞内结冰的伤害； 3）在冷冻过程中减少冰的形成，从而减少组织内溶质数量的迅速升高。 4）糖类物质（如海藻糖）对膜也具有一定的保护作用。 一种防冻剂难以同时具备所有防冻特性，在实践中往往采用多种防冻剂配合使用，以便取得更好的效果。 化冻时还要防止细胞内次生结冰，多数情况下采用快速化冻方法，即在34~40℃温水浴中化冻。 3.超低温保存主要设备和基本操作程序 主要仪器设备：1）用于细胞和组织培养的全套设备；2）普通冰箱；3）-70 ℃，-20 ℃低温冰箱；4）程序降温仪；5）盛装材料的玻璃或塑料试管，且封盖严密；6）液氮罐；7）光学显微镜和分光光度计，紫外荧光显微镜。 超低温保存的主要环节 材料的准备 （选择适宜年龄与生长状态的植物器官、组织、细胞和原生质体等） ↓ 预处理 （加速继代、提高培养基渗透压、低温锻炼、ABA处理等） ↙ ↓ ↘ 加入冷冻保护剂（0℃左右或室温） ↓ 干燥法 缓慢降温法 两步降温法 快冻法 逐级降温法 包埋脱水法 ↓ 种质保存（-196℃） ↓ 快速解冻（34 ~ 40℃）、洗涤 ↓ 再培养（细胞生长、植株再生、遗传稳定性鉴定） 4.超低温保存材料的类型 1）芽及茎尖分生组织 芽的超低温保存是保存无性繁殖植物种质的简便途径。 分生组织作为超低温保存的材料的优越性： A.在某些情况下，愈伤组织很难再生完整植株，而分生组织相对会容易很多； B.分生组织遗传上更稳定； C.更快的营养繁殖方式； D.产生无病植株； E.细胞培养物一般需要控制冷冻速度，而分生组织则可经受突然的冷冻。 2）幼胚及胚状体 A.顽拗型种子由于对温度及湿度极其敏感，常导致胚的退化，因而无法长期保存。而通过分离出胚或片段进行低温保存，是解决这一难题的有效途径。 B.体细胞胚能迅速大