酶工程实验修正14版.pdfVIP

实验一 大蒜SOD 分离与提取 实验目的：了解和学习酶的分离与提取方法 SOD （超氧化物歧化酶）是一种源于生命体的活性物质，能消除生 物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充 SOD 具 有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）是1938 年Marn 等人首次从牛红血球中分离得到 超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD 的研究己有七十多年的历史。 1969 年McCord 等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性， 弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为 超氧化物歧化酶。 在动植物和微生物中都含有SOD，本实验从蒜中分离与提取SOD。 280nm 和260nm 的吸收差法测蛋白质原理：核酸在260nm 处的吸收 更强，其吸收高峰在260nm 附近。核酸260nm 处的消光系数是280nm 处的2 倍，而蛋白质则相反，280nm 紫外吸收值大于260nm 的吸收值。 通常： 纯蛋白质的光吸收比值：a280/a260 = 1.8 纯核酸的光吸收比值： a280/a260 = 0.5 含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其a280 和a260，由此吸收差值， 用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×a280－0.74×a260 一、 实验材料与试剂： 新鲜大蒜(每组20g) ，丙酮，冷丙酮 （4 度冰箱存放），磷酸缓冲液 pH8.3，邻苯三酚、浓盐酸，1M 盐酸，冰块 邻苯三酚 （焦性没食子酚，焦性没食子酸；1,2,3-苯三酚，焦棓酸； 连苯三酚；）用0.02M 的盐酸配制。 二、 实验仪器： 摔碎机，超声波破碎仪，12000rpm 冷冻离心机，紫外分光光 度计，石英砂、研钵，2-20uL 移液枪、天平、50mL 离心管 ,具塞 试管 三、 实验步骤 1. 酶粗液制备 新鲜大蒜清水洗静后，用蒸馏水清洗，滤纸吸干，称取10g， 捣碎后，加蒸馏水6ml，300w 超声波破碎5min，过滤取上清 液。 2. 将上清液置于60℃水浴20min，2000 转离心6 分钟。取上清液。 3. 一次丙酮提纯 用盐酸调节SOD 粗提液至pH5.0，加入0.6 倍体积的冷丙酮，搅 拌均匀后。取3ml，12000rpm 冷冻离心10min，除去杂蛋白；取 上清液, 测酶活和蛋白质含量。 4. 酶液活性测定 提取液、粗酶液、酶液中SOD 活力检测，具体步骤如下。 于试管中加入4.5mLpH8.3 磷酸缓冲液，加入待测SOD10uL，25℃ 水浴中保温10min，加入50mmol/L 的邻笨三酚10uL，迅速摇匀，倒 入1cm 比色杯内，320nm 下每隔30s 测一次OD 值，共测4min。自氧 化速率变化在4min 内有效。此时邻笨三酚自氧化速率记为△ A(A/min),控制SOD 浓度使邻笨三酚自氧化速率降至0.035 A/min 左 右。 SOD 酶活计算： 5 溶液中可溶性蛋白含量测定： 公式 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280－ 0.74A260) ×稀释倍数 蛋白质浓度（mg/ml） 溶液应该稀释到量程，稀释倍数10X 左右。 四、实验结果及数据处理： 要求计算总活力，比活力。 实验二 果胶酶制取果汁实验 实验目的：了解果胶酶的性质和学习果胶酶在果汁处理中的应用 果胶酶(pectinase )是分解果胶的一个多酶复合物，通常包括原 果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶。通过它们的联合作用使果胶质 得以完全分解。天然的果胶质在原果胶酶作用下，转化成水可溶性的 果胶；果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基团，生成果胶酸；果胶 酸经果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶类降解生成半乳糖醛酸。果胶酶 由黑曲霉经发酵精制而得。外观呈浅黄色粉末状。果胶酶主要用于果 蔬汁饮料及果酒的榨汁及澄清，对分解果胶具有良好的作用。 实验材料： 苹果，每组2 个 果胶酶（参考：广州明远工贸有限公司产品 活力为26 000 PG/mL, 作用温度范围为20~50℃，超过80℃灭酶；酶的作用pH 值为3.0~5.5） 纱布,烧杯，试管。 主要仪器