药理学试验五.ppt

腺苷酸环化酶活性测定 相关背景 实验原理 实验步骤 问题讨论 Background Review cAMP是多种激素、神经递质等作用于细胞时的第二信使物质。由腺苷酸环化酶AC催化ATP分解而成。 ATP ? cAMP ＋ ppi Background Review cAMP生成以后又在环磷酸腺苷酸二酯酶（PDE）的作用下分解失活。 这样AC和PDE共同维持体内的cAMP的动态平衡。 cAMP的浓度与细胞效应密切相关，因而调节AC以及PDE的活性即可以影响细胞的功能，其中AC活性的调节乃多种受体激活产生细胞效应的中心环节之一。 Background Review 中枢神经系统中存在多个多巴胺效应系统，其中尾状核是多巴胺受体分布较为丰富的区域，其作用与调节锥体外系的功能有关。 多巴胺与细胞表面的受体结合，通过影响AC活性而发挥作用，很多抗精神病的药物是多巴胺受点的拮抗剂，这些药物不仅能抑制多巴胺与受体的结合，而且也抑制AC的活性。 腺苷酸环化酶活性测定 相关背景 实验原理 实验步骤 问题讨论 Principle 本实验采用非标记底物法测定AC活性。即用非标记的ATP作底物，其被AC催化所形成的cAMP可以不经过分离通过蛋白竞争结合法直接进行含量测定，方法简便灵敏度高。 非标记底物测定cAMP浓度，间接推测AC活性的大小，同时观察多巴胺和氟哌啶酶对AC活性的影响。 腺苷酸环化酶活性测定 相关背景 实验原理 实验步骤 问题讨论 Procedure 配制标准cAMP浓度梯度： Procedure Procedure 开动计时器，同时向第一管中加入大鼠尾状核匀浆液，100μl，摇匀。 每间隔10s，向下一管中加入大鼠尾状核匀浆液，100μl，摇匀。 1－2管：立即置沸水浴中，煮沸5min。取出，置冰浴中，10min。 Procedure Procedure 然后加活性炭混悬液，立即12000rpm离心5min。 小心吸取上清200μl，转入液闪瓶中，加5ml闪烁液，加3ml无水乙醇。（本实验中为已经配好的混合液，吸取两次，每次4ml即可）加盖摇匀，过夜。 测闪烁计数 腺苷酸环化酶活性测定 相关背景 实验原理 实验步骤 问题讨论 Discussion 本实验为微量实验，所以加样等操作精确度对结果影响很大 各管加样准确 各组时间平行 Discussion 加入活性碳后应立即离心 因活性炭对游离3H-CAMP的吸附存在动态平衡，吸附时间过长可能造成反应产物的解离，影响试验结果。 Discussion BSA的作用？ 加入ATP的作用？ 加入无水乙醇的作用？ 加入沸水浴的作用？ 倍比稀释的优点与缺点？ 分析可能影响试验结果的因素，并讨论如何控制这些因素优化试验 Discussion 根据药理学的理论知识预测试验的结果； 用合适的方法分析并解释你自己得到的数据和结论。 谢谢大家 * * * * 北京协和医学院八年制临床医学生药理学实验 药理学系 郭磊 AC Alfred G. Gilman 母液 100ul T.E 32pmol/100ul 16pmol/100ul 8pmol/100ul 4pmol/100ul 100ul T.E 100ul T.E 100ul 100ul 100ul 100ul 母液 100ul T.E 取小试管10支，依次编号，置试管架中。 按下表加入各种试剂 50 50 50 250 9－10 E 50 50 —— 300 7－8 D 50 —— 50 300 5－6 C 50 —— —— 350 3－4 B 50 —— —— 350 1－2 A 10mM ATP μl 250μM氟哌啶醇μl 200μM多巴胺μl Tris苹果酸缓冲液 编号 分组 6 5 4 3 2 1 100 50 50 100 — — 31－32 E 100 50 50 100 — — 29－30 D 100 50 50 100 — — 27－28 C 100 50 50 100 — — 25－26 B 100 50 50 100 — — 23－24 A 样品管 100 50 50 — 100 — 19－20 S7 … … … … … … … … 100 50 50 — 100 — 7－8 S1 标准管 100 50 50 — — 100 5－6 C0 100 — 50 — — 150 3－4 B — — 50 — — 250 1－2 CT 比较管 10000rpm离心5min，取上清200μl，测定放射性。 活性炭μl 摇匀，4摄氏度放置2小时 结合蛋白μl 3H－cAMPμl 待测样品μl 标准品cAMPμl TEμl 编号 分组 分类 4000rpm离心5min，各管取上清100μl按下表加样 现在我们应用更先进的液