第五单元1 分子生物学研究法(上).pptVIP

基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的表达和繁殖。 基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有跨越天然物种屏障、能把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞中。 3.聚合酶链式反应技术 PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC) PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C, Taq DNA polymerase catalyses primer extension End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence Cleavage Probes (TaqManTM) 基因文库（gene library）：应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的DNA克隆。基因文库是包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 基因文库包括基因组文库(Genome library) 和cDNA文库(cDNA library) 4、cDNA文库构建 　双链cDNA经限制性内切酶酶切，产生的片段与适当载体连接后转入受体细菌或噬菌体，即获得cDNA文库。与基因组DNA文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息。 前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在 5％以内 1、用内参基因的CT值确定目标基因的CT值： ΔCT (test)= CT (target,test) – CT (ref,test) ΔCT(calibrator)= CT (target, calibrator) – CT(ref, calibrator) 2、用校准样本的ΔCT值确定试验样本的ΔCT值： ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator) 3、计算表达水平比率： (1+E) –ΔΔCT=表达量的比值 相对定量分析法：-ΔΔCt法 5、基因组DNA文库构建 基因组文库 分离组织或细胞染色体DNA，利用限制性核酸内切酶切割成许多片段，将它们与适当的克隆载体连接成重组DNA分子，继而转入受体菌中扩增，不同细菌所包含的重组DNA分子内可能存在不同的染色体DNA片段，这样全部细菌所携带的各种染色体片段就代表了整个基因组。 存在于转化细菌或噬菌体内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称基因组DNA文库。 三、RNA基本操作技术 1、总RNA的提取 2、mRNA的纯化 用试剂盒提取总RNA 加入与生物素相连的寡聚(dT)引物温育 加入与微磁球相连的抗生物素蛋白 用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA 洗脱得到mRNA 3、反转录生成cDNA 以寡聚dT或随机6核苷酸为引物 反转录酶 cDNA第一链 以cDNA第一链为模板合成cDNA第二链 加接头准备与载体连接 a-互补显色反应（蓝白斑筛选） lacZ - β-半乳糖苷酶- 分解半乳糖苷 i P O 调控蛋白P 分解X-gal 产物呈现蓝色 诱导剂IPTG 宿主含有β-半乳糖苷酶lacZ基因的3′端序列 X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷) IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷) α肽段 噬菌体重组体DNA分子的体外包装法 DNA 聚合酶 在核苷酸底物存在下，以一条DNA链为模板催化新链合成 需要3’ -OH 引物 5’ 到3’ 方向合成DNA 通常具有 3’到 5’ 外切酶活性 PCR扩增原理 引物 延伸 延伸 5′ 5′ 3′ 3′ 变性、退火 变性、退火 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 5′ 每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 理论上最高值2n PCR仪 PCR技术的应用 1) 基因克隆 重组DNA 质粒DNA 基因片段 2)基因检测 A′ 内源性病变基因 正常人 A 病 人 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+) 3）表达分析 4）探针制备 5）定点突变 4、实时定量PCR 常规PCR方法的局限性： 无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析 必须在扩增