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第七章 光学检测技术 利用物质所具有的各种光学性质，对物质进行定性、定量及结构分析的技术。 包括：旋光检测、析光检测、荧光检测、分光光度检测、散射光谱检测等。 生化领域常用：分光光度检测、旋光检测、荧光检测 一 分光光度检测 又称分子吸收光谱检测，是利用物质分子所特有的吸收光谱而对物质进行定性定量测定的检测技术。 紫外分光光度检测（200～400nm） 可见光分光光度检测（400～760nm） 红外光分光光度检测（760～10000nm） 1 样品溶液的配备 （1）对各种光有选择性吸收特性的物质 （2）本身没有颜色的物质，转变为有色的物质溶液 2 样品的检测 选择好入射光的波长，空白液调零，测定。 3 待测物质的定性分析 （1）将样品溶液在一定条件下（pH、温度、缓冲液等）测得的吸收光谱与物质的标准吸收光谱相对照，推断样品是什么。 （2）根据样品吸收光谱中峰顶与峰谷吸光度之比值，与相当条件下资料所载的比值比较，推断样品是什么。 如 ATP: OD280/OD260=0.85, OD250/ OD260=0.90 AMP: OD250/OD260=0.85, OD280/OD260=0.22 (3)将分光光度检测与层析或电泳分离技术相配合，综合判断。 4 待测物质的定量分析 （1）标准曲线法 注意：对于存在有干扰物质的样品要进行校正。 （2）Lambert-Beer E=KCL, K-消光系数 二 旋光检测技术 利用旋光计测量出旋光物质（光学活性物质）对偏振光旋转角度的方向（左旋或右旋）和大小，从而进行定性与定量分析的技术，称为旋光检测技术。 旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该物质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称为旋光度。左旋（－），右旋（＋）。 物质的旋光度主要取决于物质本身的结构，此外与入射光的波长及温度有关，对溶液而言，还与溶液性质、溶液浓度和溶液厚度有密切关系。 溶剂确定后， α ＝[α]tλ LC/100 α － 旋光度 L －溶液厚度（分米）[α]tλ －比旋光度，通常采用[α]20D L －溶液厚度（分米） C－溶液浓度，100mL溶液中所含物质的克数。 根据物质的[α]20D 和实际测出的α，可计算得到C= α× 100/ ([α]tλ L) 操作要点： （1）样品液的配制 （2）旋光度的测定 旋光法测定味精浓度 样品溶液配制 精确称取味精样品10.00g，加40～50mL蒸馏水溶解，搅拌加入分析纯盐酸16mL，使味精全部溶解。冷却至室温，蒸馏水定容至100mL。 旋光仪调零 预热10min，放进滤光片。取16mL分析纯盐酸蒸馏水定容至100mL。装满旋光管，调整零点。 样品液测定 样品洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品室，测定旋光度，记录温度。 计算 C= α× 100/ ([α]tλ L) [α]tλ＝32＋0.06×（20－t) C味=C×187.13/147.13 味精纯度＝ C味/样品重量 三 荧光检测技术 有些物质的分子吸收了一定波长的光（辐射能），分子内电子被激发到较高的能级以后，由于电子旋转或酸离解等消耗一部分能量，当电子返回到低能级状态时，重新放出较长波长的光，这就是荧光。 不同物质放射的荧光光谱不同，荧光的强度与物质的浓度有关。 检测方法 直接检测荧光性物质 利用非荧光物质与荧光试剂反应后检测 在荧光性物质溶液中加入消光物质，测定荧光的减少 常用物质测定的荧光试剂p183(自学） 思考题 生化中的光学检测方法主要有哪些? 分光光度法如何对物质进行定性定量? 旋光法如何测定光学活性物质含量(计算)? 荧光检测中蛋白质和氨基酸常用的荧光试剂是什么? * *