4.1.第四章基因工程的主要技术及其原理1案例.ppt

　　1.掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法 　　2.掌握总RNA提取及第一链cDNA的合成 3.掌握PCR技术的原理及引物设计的方法 　　4.掌握不同凝胶电泳的差别 　　5.了解PCR技术的种类 　　 核酸提取与纯化的原则 保持核酸分子一级结构的完整性 温度不要过高，核酸提取常常在0～4℃的条件下进行 控制一定的pH值范围(pH值5-9) 保持一定的离子强度 减少物理因素对核酸降解的机械剪切力 防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 核酸提取的一般流程 DNA提取的几种方法 基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 基因组DNACTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 质粒DNA提取碱裂解法 碱裂解法是利用共价闭合环状质粒与线性染色质体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。 几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。 溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25 mMTris-HCl pH8.0 ) 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活。 溶液II (0.2mol/L NaOH, 1%SDS, 现用现配) 作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 溶液III (3M乙酸钾溶液,pH=4.8) 作用：中和NaOH，使质粒DNA复性，变性蛋白－SDS和线性DNA沉淀。 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 总RNA的提取最常用方法酚-异硫氰酸胍（Trizol法） 原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。 制备RNA的关键防止内外源RNase的作用使RNA 降解 1)??RNase的特点： 抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 抗高温严寒(0~65℃均具活性） 2)??解决办法： 外源RNase—高温，DEPC处理所有溶液 和器皿，操作者戴手套，戴口罩 内源Rnase—强蛋白质变性剂，RNase抑制剂等 RNA酶强抑制剂DEPC(二乙基焦碳酸盐)，剧毒。 注意： 提取过程应尽量保持低温 所用试剂均要求无菌！！！且忌交叉污染！！！ 质量检测（浓度和纯度）———紫外分光光度法 原理： 基于DNA(或RNA)分子在260nmm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。 分子形状、双链与单链之间的转换也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来校正。 在260nm紫外光下，1 OD的吸光度相当于 双链DNA浓度为50μg/ml； 单链DNA为37 μg/ml； RNA为40 μg/ml。 质量检测（浓度和纯度）———紫外分光光度法 测DNA： 质量检测（浓度和纯度）———紫外分光光度法 测RNA： 相对分子质量的测定和分离 ———凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖变性胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 脉冲电场凝胶电泳 凝胶电泳中DNA的检测 PCR 基因放大连琐反应 平台期与平台效应 　　PCR经过一定数量的循环后，D