mofloXDP流式细胞仪基本原理以及应用案例.pptx

流式细胞仪基本原理以及应用 张宇廷 Beckman Coulter 细胞研究必备的仪器 细胞成像、定位（单个细胞） 细胞定量测定 （群体细胞特征） 分析型：一个细胞的身世：我是谁 混杂的细胞群 激光激发标记在细胞上的荧光素 Directly to waste 仪器的电子系统收集荧光信号并处理 信号 计算机工作站对信号进行收集和统计 流式细胞仪是通过对目标细胞上的荧光信号进行识别而实现对细胞的定量 一个细胞的命运 混杂的细胞群 身份的鉴定 识别和通过的速度 分选是一个复杂的过程 流式细胞仪是细胞组学的定量工具 可以做以下定量： 细胞相对定量（％） 细胞绝对定量（细胞/μl） 细胞膜蛋白表达定量（蛋白分子/细胞） 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 流式细胞仪基本原理 通过激光激发高速流动的细胞或微粒所携带的荧光染料或荧光素，并检测由此产生各种光信号，如散射光、自发荧光、特异性荧光的强弱，来反映各项待检测指标。 成功的流式实验需要三步走： 下游实验,培养或者其他生物手段验证 流式样本制备 单细胞悬液制备 样本保存 荧光标记 设置对照 单细胞悬液制备 样本浓度要求：建议105~106/ml 血样本 样本要求：EDTA、肝素、柠檬酸钠抗凝全血 凝血、溶血样本应当弃用 白细胞样本：需裂解去除红细胞 裂解液的选择：甲酸 作用强，适用于一般检测 氯化铵 作用温和，适用于低含量细胞 注意：温度过低会影响裂解效果 红细胞样本：PBS或生理盐水稀释1000倍 血小板样本：避免使用肝素抗凝血， PBS或生理盐水稀释20倍 培养细胞 一般处理：消化分散成单细胞，过300目滤网去除细胞团块 易聚集的细胞：可在缓冲液中加1~3%的小牛血清或BSA或0.05%EDTA 单细胞悬液制备 组织细胞 脾细胞，在缓冲液中将血洗净，剪成数块，直接在300目滤网上研碎过筛 肝、肾组织及结肠癌等富含实质细胞的组织，于缓冲液中充分剪碎，细胞分散于缓冲液中，过100目滤网，再过300目滤网 肺、肠粘膜等结缔组织较多的组织，剪碎并用胰酶、胶原酶等消化分散 骨、软骨、心肌、骨骼肌、脑组织等，可尝试机械剪碎及酶消化后于培养液中静置贴壁分离细胞，但可用的细胞往往较少，最好进行原代培养 单细胞悬液制备 外周血样本：在不处理的情况下于4度存放3~5天，仍可用于大多数 表面分子标记检测。但做细胞绝对计数应在24h内检测 固定：低浓度的甲醛或多聚甲醛固定（1%）可用于培养细胞或已 分散成单细胞的组织来源样本的短期保存（1周） 过高浓度的甲醛会影响抗原抗体结合及导致荧光淬灭，不适合流式检测 长期保存：可参考细胞和组织的冻存（深低温或液氮） DNA倍体检测：可用-20度预冷乙醇固定（终浓度80%），固定时 震荡逐滴加入，避免结块，1~2ml/样本，存放于-20度（1月） 注意：已标记荧光的样本和对细胞活力有要求的样本应尽快检测， 以免荧光淬灭及细胞活力丧失 样本保存 荧光标记 表面抗原标记：抗体用量106cells/test 冻干粉可以0.5~1ug/106cells为起始量 脂溶性染料：可直接进入细胞内 细胞内抗原标记及水溶性染料：需要膜通透试剂处理 膜通透试剂的选择 甲醇：中等，可能导致部分蛋白变性 皂素：温和，对细胞形态影响小 Triton-X100：强烈，对细胞形态影响大 商品化试剂：含有上述多种成分，不同组合用途不同 荧光素的选择 激发波长 发射波长 激光 荧光通道 荧光素的选择 PerCP FITC APC ECD PC5 PC7 PE 荧光素的强度 荧光检测通道之间的干扰 FITC (F/P Ratio 3-5) PE (1/Anti