一株大黄鱼病原菌——诺卡氏菌的鉴定及其系统发育分析.pdfVIP

福建曩付 第三届海洋生物高技术论坛 2005．08．19．23 一株大黄鱼病原菌——诺卡氏菌的鉴定及其系统发育分析+ 王国良4，袁思平，金珊 (宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波315211) 摘要：一株大黄鱼结节痛病原茵，革兰氏阳性，好氧，具有弱抗酸性，菌体呈长或短杆 状，或细长分枝状，过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性，还原硝酸盐，不水解酪素、黄嘌呤、 酪氨酸、淀粉和明胶，能以柠檬酸盐为唯一碳源生长。对其16SrRNA基因进行了PCR 扩增、测序和系统发育分析，结果表明该菌株与诺卡氏菌属的菌株亲缘关系最近，与 serioleaJCM 鱼诺卡氏菌Nocardia 据此鉴定该菌株为 鱼诺卡氏菌(Nocardiaseriolea)。 关键词：诺卡氏茵属； 鱼诺卡氏茵：16SrRNA；系统发育 诺#氏菌属于细菌域，厚蹙菌门，放线细菌纲，放线菌目，诺卡氏菌科【l】。一种革兰氏 阳性丝状杆菌，与分枝杆菌关系相近，广泛分布在土壤、活性污泥、水、动植物和人的组织 中，以腐生为主。一些菌株是人和动物的机会致病菌。但由于分离、分类方法所限，绝大多数 (85％以上)还没有被人们所认识…。对该大黄鱼病原菌的分类研究不仅为有效控制该病提供理 论指导而且为放线菌的开发丰富内容。 随着科学技术的发展，诺卡氏菌的分类已由最初的以形态描述、生理生化特征为主发展到 现在的多相分类。在多相分类的众多方法中，分子生物学方法，尤其是16SrRNA基因序列相 似性分析的作用日益突出，已成为建立新分类单位必不可少的资料。本实验主要通过 16SrRNA基因序列相似性分析，鉴定一株大黄鱼病原菌为鲕鱼诺卡氏菌(N．seriolea)。 1材料和方法 1．1菌株及培养条件 供试菌株H031016，分离自浙江台州、舟山海水网箱养殖患结节病大黄鱼，该菌株己通 过同复感染证实为该病的病原菌。培养基为胰胨大豆琼脂(TSA)。28C培养7．10天，备用。 1．2形态结构观察及生理生化试验 1．2．1电镜观察：将供试菌株制成菌悬液，吸取一滴置于铜网膜上，醋酸铀染色，日立H一300 型透射电子显微镜观察。 Manualof 4)¨1、中科 1．2．2生理生化实验：按照((Bergey’SSystematicBacteriology))(Volume 院微生物研究所放线菌分类组刘志恒13]的相应属、种鉴定有关内容和方法，对供试菌株的酶 类产生、水解活性、单一碳源生长及温度耐受性进行了研究。 1．316SrRNA基因的PCR扩增 基侧PCR扩增0f物分别为：P1： 试剂盒。PCR产物直接测序，测序工作由上海基康生物有限公司用ABl377DNA自动测序 仪测序。测序引物分别为：P1： +浙江省自然科学基金资助项目(Y304078) $通讯作省’。E—mail：wanggl@nbip．net 福建凌r】 第三禽海洋生物高技术论坛 2005．08．19．23 P4：5’一GCAGTTCAGGCTCATATCC一3’： P5：5’．CCCCGTGAAGTrGGAGTC一3’。 1．4系统发育分析 所测序列利用GeneBank数据库中的BLAST进行相似性比较，根据返回的结果，从 Alignments)分析，最后形成一个多重序列匹配排列阵，其中形成的缺口用“一”填补，用N-J法 构建系统进化树，并进行Bootstrap检验(1000次重复)。 2结果和分析 2．1形态学特征 病原菌革兰氏阳性，好氧，具有弱抗酸性，菌体呈长或短杆状，或细长分枝状，常断裂 成杆状至球状体，赢径0．2．】．0“m，长2．0．5．O“m。可单个、成对、Y或V字状排列或排列成 栅状，有假分枝，并具膨大或棒状末端(图1)。不运动，不生孢子。病原菌生长缓慢，在 TSA、L—D和小川培养基上28℃，7．10天才能长出，菌落呈白色或淡黄色沙粒状，粗糙易碎， 边缘不整齐，偶尔在表面形成皱折。该菌基丝发达、繁茂，呈分枝状，丝状体长10—501am。 图1 病原菌的个体形态(12000x) ofthe bacte