纤维素柱的制备及其在超氧化歧化酶提纯中的应用-武汉大学化学实验.doc

纤维素柱的制备及其在超氧化歧化酶提纯中的应用 武余波 王晓东 （武汉大学 化学与分子科学学院 应用化学教改班 ） 摘要： 本实验以纤维素铜氨溶液制得高分子的分级、尺寸排除色谱的纤维素填料，用梯度洗脱法分离经过离心的从猪血中提取的超氧化歧化酶，并在２８０ｎｍ处用紫外吸收法测定吸光度绘制淋洗曲线。 关键词 ：纤维素 超氧化歧化酶 部分收集 梯度洗脱 一、前言 高分子与小分子的一个显著的区别在于其性质与其分子量密切相关。在生物高分子的研究中需要对生物大分子进行分级。但是，传统的有机沉淀剂的使用会导致生物大分子的变性失去活性，尺寸排斥色谱可以避免上述的问题，因而在生物大分子的研究中得到了广泛应用。 尺寸排斥色谱的基本原理是基于高分子的分子量不同而得到分离的。当高分子流过孔径具有一定尺寸分布的色谱柱填料时，分子量小的高分子由于尺寸小进入空隙的几率较大，运动的路径较长，其保留时间较长，较晚流出色谱柱，从而达到分离的目的。 常用的分级填料是交联葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，但价格昂贵，难于大规模应用。利用来源丰富的纤维素置备色谱柱填料不仅价格低廉而且节约石油资源保护环境。尽管使用纤维素作为原料已制备了强度高，尺寸稳定性好，分辨率高的SEC填料；但由于孔径太窄，分级范围很窄，应用受到很大的限制。通过最新的研究发现，使用聚乙二醇和纤维素铜氨溶液共混可以得到孔径合适的填料，本文通过对这种新型填料在超氧歧化酶分离中的应用表征了填料的性能。 超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在于生物体中，按照其所含有的金属离子的不同分为：铜锌超氧化物歧化酶（Cu·Zn- SOD）CuSO4·5H2O，20%NaOH，PEG—2000，短棉绒，4％硫酸，异丙醇，浓氨水，95％乙醇，氯仿，K2HPO4·3H2O，K2HPO4，0.9%NaCl，丙酮，10mmol/LHCl，邻苯三酚（用10mmol/L HCl作溶剂配制，4℃下保存 ），新鲜猪血500ml，2.5%草酸钾，甲醛溶液。 2．2. 仪器 烧杯(250mL、500mL、50mL各2个)，量筒(10mL,100mL各一个)，1000mL分液漏斗(1个)，药匙，洗瓶，抽滤装置（抽滤瓶、布氏漏斗各两个），玻璃搅拌棒，恒流泵，自动部分收集器（1个），淋洗液瓶（2个），电磁搅拌器（1个），试管（5mL），台秤，机械水泵，真空干燥器，电炉，注射器及针头，紫外可见分光光度计，分析天平，低温高速离心机，冰箱。 2．3 实验步骤 1. 酶的制备 （1）取新鲜猪血500mL（已预先加入50mL2.5%草酸钾作为抗凝剂），3000转/min离心20min去除上层血浆，收集红细胞约250mL，加入等体积的0.9%NaCl溶液，用玻璃棒搅拌充分，洗涤，3000转/min离心20min，弃去上层清液（如此反复3次），收集洗净的红细胞放入800mL烧杯中，加250mL重蒸水，将烧杯置于冰浴中搅拌40min以上，得溶血液500mL。 （2）往溶液中缓慢加入在4℃下预冷过的95%的乙醇125mL，然后缓慢加入在4℃下预冷过的氯仿75mL，搅拌15min，室温下3000转/min离心20min，弃去沉淀，收集上层清液约330mL，此即酶的粗提取液。 （3）往上述液中加入 141.9gK2HPO4·3H2O和22.3g蒸馏水 ，转移到分液漏斗中，振荡后静止分层（约15min）。收集上层乙醇—氯仿相（微浑浊），室温下离心（3500转/min）25min，弃去沉淀，得上层清液约150mL。 （4）向所得溶液中加入0.75倍体积的在４℃下预冷过的丙酮， Cu·Zn-SOD便沉淀下来。室温下3500转/min离心20min，收集灰白色沉淀物。将此灰白色沉淀物溶于约5mL蒸馏水中（呈悬浮状），在４℃下，250mL2.5mmol/L（PH值为7.6）的磷酸钾缓冲溶液中透析，每隔半小时换一次透析液，共换4～5次。透析液内出现沉淀，在室温下3500转/min离心，弃去沉淀收集上清液于小试管中，在冰箱中保存。 2. 纤维素柱的制备 （1）制备Cu(OH)2 取16.5g CuSO4·5H2O加132mL水，搅拌加热至沸后，停止加热，缓缓加入8mL25%~28%的浓氨水，并搅拌。冷却至室温后，用水将沉淀洗至中性。倒出清液后，加112mL水入沉淀中，冰水浴条件下加入53mL 20% NaOH溶液并搅拌，再用水洗至中性，抽滤得天蓝色湿的Cu(OH)2（含水率约60%）。 （2）制备纤维素铜氨溶液 8g纤维素置于56mL浓氨水中，加入13mL水后密封杯口，置于冰箱中冷至10℃以下。将10.4g含水率约为60%的Cu(OH)2加入到6mL 10% NaOH溶液里，搅拌均匀后倒入上述冷却的纤维素氨水溶液中，立即搅拌均匀，置于