第二发酵工业菌种与种子的扩大培养.pptVIP

三、冷冻保藏 冷冻保藏为保藏微生物菌种最简单而有效的方法。 通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。 １.普通冷冻保藏技术(-20℃) 将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管，然后贮藏于冰箱的冷藏室中，或于-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。 用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。 三、冷冻保藏 应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。 保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。 这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。 三、冷冻保藏 １.普通冷冻保藏技术(-20℃) ２.超低温冷冻保藏技术(-60 ～ -80℃) 要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。 三、冷冻保藏 如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。 超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。 若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。 三、冷冻保藏 ２. 超低温冷冻保藏技术(-60 ～ -80℃) 3. 液氮冷冻保藏技术 (1)冷冻保护剂 在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。 三、冷冻保藏 (2)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 A．待冷冻保藏菌种悬液的制备 B．控速冷冻 三、冷冻保藏 3. 液氮冷冻保藏技术 (3)复苏 A．从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中； B．迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解； C．用巴氏吸管将安瓿中培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml(约4~8滴)转接入琼脂斜面上。 三、冷冻保藏 四、冻干保藏 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。 冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。 大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。 1.培养物的冻干过程 四、冻干保藏 2. 冻干菌种的保藏与再生 （1）保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好。 （2）复苏： A.在超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。 (2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿． 四、冻干保藏 C.在安瓿中加入0.5～1ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。 D.在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l～2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5～l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。 四、冻干保藏 2. 冻干菌种的保藏与再生 （2）复苏： 1. 传代保藏 将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。 可用于实验室中若干菌种的保藏。 此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。 但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。 五、其他保藏方法 要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。 斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并能降低代谢活性。 此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏方法。 五、其他保藏方法 1. 传代保藏 2. 矿物油中浸没保藏 将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。 可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。 五、其他保藏方法 浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170℃下灭菌1-2h的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。 以