华根霉产合成脂肪酶同工酶在固态发酵中的生产纯化及性质研究.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四次全国发酵工程学术讨论会论文集 华根霉产合成脂肪酶同工酶在固态发酵中的生产 纯化及性质研究 孙舒扬，王 栋，徐岩 (江南大学生物工程学院，无锡214036) 摘要：华根霉CCTCCM201021在固态发酵中培养，通过发酵过程跟踪发现全细胞脂肪酶 的水解活力和合成活力存在不对应性；考察了橄榄油对固态发酵产脂肪酶的影响，发现橄 榄油不仅是菌体生长所必需的一种碳源而且是水解脂肪酶和合成脂肪酶分泌的双重诱导 物。合成脂肪酶是结合在细胞膜上的。采用水解活力和合成活力两种纯化标准，经过硫酸 铵沉淀，辛基魂水层析，苯基疏水层析以及凝胶过滤层析，得到了合成脂肪酶同工酶I和Ⅱ， 0，40。C和9．0，45。C．脂肪酶I和Ⅱ催化短链酯合成的转化率基本都可以达到90％． 关键词：脂肪酶；合成活力，固态发酵；纯化；同工酶 前言 脂肪酶(EC3．1．1．3)是作用于油水界面催化酯键合成或水解的一类酶，能够催化酯 合成、转酯化、酯聚合、肽合成以及酰胺合成口’23等反应。最近几年其在有机合成中的作 biotechnology)。 用日益突出，被称为脂肪酶生物技术(1ipase 微生物是脂肪酶生产的重要来源。不同微生物生产的脂肪酶不同，有些株菌还可以 chinensisCCTCC 产多种性质不同的脂肪酶CsJ。华根霉(Rhizopus M201021)是从大曲 中分离得到的，较适合在固态发酵中培养，并且能够产生性质不同的脂肪酶。华根霉全 细胞脂肪酶还具有很强的酯合成能力，在短链酯合成中有较强的优势“_1叫。 在脂肪酶的纯化中，水解活力是目前采用的唯一指标，但是就纯酶而言，其水解活力 和合成活力存在不对应性，单单以水解活力作为指标不能完全反映纯化过程，因而本文 把合成活力作为另一个指标对华根霉产酯合成脂肪酶进行纯化，并对纯酶的部分性质进 行了研究。 1 材料与方法 1．1菌种与培养基 chinensisCCTCC 菌种：华根霉(Rhizopus M201021)，培养基：葡萄糖1．29，豆饼粉 120。C灭菌20分钟待用。 1．2菌种与培养基 孙舒扬等：华根霉产合成脂肪酶同工酶在固态发酵中的生产，纯化及性质研究 673 种完毕后放置于30。C的恒温培养箱中，间隔8小时取样并分析。发酵产生的茵体均用 去离子水以及pH7．5的磷酸缓冲溶液多次浸洗，将残留的培养基去除，再将菌体浸于适 量pH7．5的磷酸缓冲液中，于冷冻干燥机中冻干制得。 1．3 固态发酵产合成脂肪酶的纯化 固态发酵培养3d的菌体经研磨破碎细胞后，离心去除胞内杂蛋白，加入表面活性剂 Fast 萃取出目的蛋白，再经硫酸铵沉淀、Octyl—SepharoseFlow疏水层析、Phenyl— Fast SepharoseFlow疏水层析和SuperdexG75凝胶过滤层析。 1．4分析测定方法 chinensisCCTCC 麦角固醇作为Rhizopus M201021生长状况的指示物[1¨。脂肪酶 水解酶活测定一橄榄油乳化液法[12]和pNPP法[1朝。脂肪酶合成酶活测定：分别取浓度 醇为内标，气相检测生成的辛酸乙酯。气相柱为PEG20000，检测器为FID，采用程序升 个合成酶活力单位。蛋白质含量测定采用lowery法。 2结果与讨论 2．1固态发酵过程跟踪 固态发酵过程中菌体量、全细 240 胞脂肪酶的水解活性和合成活性 酶活的变化如图1所示。发酵过