non-coding RNA——现代分子生物学课程.pptVIP

RISC：RNA-Induced Silencing Complex 一种多结构域的双链RNA专一性RNase Ⅲ miRNA如何行使功能？ 与mRNA的3‘端非编码区特定位点(其第2~8个核苷酸)绑定： 与mRNA完美互补时——会引发mRNA降解； 不完美的与mRNA配对时，会引发转录后的基因沉默（抑制靶基因的表达） 从而抑制或阻止相应的mRNA翻译过程。 举例分析：在DNA修复通路中行使上述过程 1）抑制或阻止正常细胞DNA修复产生致癌作用 2）抑制或阻止癌细胞DNA修复达到治疗效果 植物miRNA 的特点 植物miRNA与动物miRNA的相类似特点 (1)miRNA广泛存在于真核生物中。 (2)miRNA 的长度约为20～24 nt。 (3)miRNA 没有开放阅读框(ORF)及蛋白质编码基因特点。 (4)miRNA的基因成簇性。 (5)miRNA 的保守性。 植物miRNA 的特点 植物miRNA与动物miRNA的相类似特点 (6)miRNA表达的时空特异性。 (7)几乎所有的miRNA从前体的1条臂中加工而来。 (8)miRNA 的5 端多以U 开头 。 植物miRNA 的特点 植物miRNA与动物miRNA的不同特点 (1)植物miRNA前体的大小变化较大，一般为64～303 nt，而动物miRNA前体的变化较小，一般为60～75 nt。 (2)植物中的miRNA较动物中的更为保守，它们与互补序列的错配数也少于动物。 植物miRNA 的形成 miRNA成熟所需的酶类 一种多结构域的双链RNA专一性RNase 1II(Dicer酶、类Dicer酶)和Argonaute蛋白。 Dicer酶包含4种结构域：RNA解旋酶结构域、PAZ(Piwi—ArgonauteZwille)结构域、2个RNaseⅢ结构域和dsRNA结合结构域(dsRBD) Argonaute蛋白具有PAZ和PIWI结构域 。 植物miRNA 的作用机制 miRNA的作用方式可根据其与靶基因的互补程度不同而分为两种：转录产物裂解和翻译抑制。 a.当miRNA与靶mRNA完全互补或接近完全互补时，则会切割mRNA； b.当植物miRNA与靶mRNA不完全互补时，则抑制其翻译。 近年来研究发现，miRNA也可以通过目标染色体位点的甲基化，或通过调控靶mRNA的定位或稳定性在转录水平上发挥作用。 植物miRNA 的功能 1 抗生物胁迫 植物中存在一类miRNA与多种植物病毒基因完全或不完全互补，推测这类miRNA 可通过切割病毒基因抑制病毒侵染。 2 抗非生物胁迫 2．1 抗营养胁迫 (1)调节植物磷代谢平衡 Chiou 发现，在磷胁迫下，拟南芥中miR399大量表达；而在高磷条件下，未检测到miR399的表达。 (2)调节植物硫代谢平衡 miR395在高硫条件下不表达，在硫缺失胁迫下表达 。 植物miRNA 的功能 2 抗非生物胁迫 2．2 抗环境胁迫 miRNA可以使植物抵抗寒冷、高浓度ABA、干旱、高盐等极端自然环境 及抵抗环境引起的自身氧化胁迫 。 miRNA的检测 miRNA的获取 miRNA的确认 miRNA的检测方法 miRNA的获取 miRNA 分子的序列短小 1）在基因组中存在较多的互补序列 2）在不同生物体内与靶基因结合的方式也不尽相同 3）通常与多种蛋白相互作用 这使得建立一个有效而且普遍适用的研究方法异常困难。 #到目前为止,miRBase上公布的miRNA总数将近3 000种。 #现在已知靶基因的miRNA多是通过基因克隆和生物信息学筛选的方法发现的。 miRNA的获取——基因克隆 1.1　基因克隆　 直接克隆的方法通常是从总RNA中提取大约22 nt的小RNA分子,制备一个小RNA的cDNA(complementary DNA)文库。将文库中的小RNA序列与基因组数据库中BLAST序列类似性 比对,排除非miRNA 序列后,通过Northern印迹方法(Northern blotting) 得到最终确认。目前大量的已知miRNA都是通过这种方法获得的。 　　基因克隆方法的优点是对于高丰度或常表达的基因来说,可以获得完整的miRNA序列。然而对于另一些miRNA,它们在生物体内浓度很低(表达量低或表达产物极不稳定,或前体到成熟的加工效率低等原因引起) ,或者某些只在生物体的特定时期或特定组织器官中表达,直接克隆法则无法获取。 注：Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 miRNA的获取——生物信息学筛选 1.2　生物信息学筛选 　随着生物全基因组测序的完成,利用计算机对基因组序列进行搜索可以大大