PCR技术的原理及操作解说.pptVIP

PCR技术的原理及操作 什么是PCR PCR: Polymerase chain reaction，即聚合酶链反应 PCR的基本工作原理： 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的原则沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。 PCR技术的原理 PCR反应包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子 基本反应步骤 ：变性--退火--延伸 最后通过染料染色DNA后显色检出 PCR技术的原理 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~35轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 RT-PCR的原理 相对于PCR，在开始阶段增加步骤：RNA ? cDNA合成，是单链到双链的过程。 RT-PCR的基本步骤 实时荧光定量PCR的原理 实时荧光定量PCR技术 (Real-Time Quantitative PCR) 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 常用的荧光定量PCR试剂： SYBR Green I Taqman水解探针 实时荧光定量PCR的原理 1. When SYBR? Green dye is added to a sample, it immediately binds to all doublestranded DNA (dsDNA) present in the sample. 2. During PCR, DNA polymerase ampl?fies the target sequence which creates the PCR products. 3. SYBR? Green dye then binds to each new copy of double-stranded DNA,generating a fluorescent signal. 实时荧光定量PCR的原理 熔解曲线:随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线 (来确定不同的反应产物，考察扩增产物是否是目标产物) 随着温度的升高，DNA双链断裂；接着温度降低，到达退火温度的时，DNA双链复性，荧光分子绑定在DNA双链上，所以荧光信号值到达最高点 接着DNA双链分子由退火温度继续升温，双链断开，DNA分子溶解 当扩增是单一产物的时，即呈现单一的溶解峰，这时，在同样的温度下，可以认为是产物相同；如果溶解峰不单一，就意味有非特异性扩增 实时荧光定量PCR的原理 扩增曲线 1. 基线（Baseline） 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。 2. 光阈值threshold的设定 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。 3.CT(Cycle threshold)值 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。  实时荧光定量PCR的原理 Ct与初始模板的关系 1. 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 2. 各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。 阈值 104 103 102 CT = - k lgX0 + b CT值 lg 起始DNA浓度