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CH 4 酶制剂的制备和精制 尽管发酵微生物的种类不同，有的是以胞内酶为主，有的以胞外酶为主，无论哪一种，最终得把它们提取出来，并使其达到一定的纯度，这就是酶制剂的制备和精制的任务。 目前我国生产的工业酶制剂，普遍纯度较低，就丹麦NOVO公司生产的酶制剂的纯度远远高于我国的产品。如果胶酶（Pectinases), NOVO公司生产的酶制剂的比酶活力较我国最好的产品高5—10倍，尽管酶制剂的价格较高，但其在生产上应用成本还低于我国的产品。 —— （细胞破碎） ——发酵液预处理 ——酶液脱色 ——酶蛋白的初步纯化与浓缩 ——（酶蛋白的提纯与精制） ——酶制剂的成形。 CH 4.1 酶制剂的工业提取方法1 细胞破碎方法 　　对于胞内酶的提取与制备，首先要把细胞破碎，使局限在细胞内的酶蛋白游离出来，常用的破碎方法有以下几种： ? 1.1 机械破碎法： 1.2 物理破碎法： 1.3 化学方法： CH 4.1 酶制剂的工业提取方法2 发酵液的预处理 2.1 发酵液絮凝 　　发酵液首先要进行过滤除菌，在发酵液中，由菌体自溶产生的细胞碎片、核酸、杂蛋白等大分子物质，使得发酵液很难过滤；在过滤前必须进行絮凝处理。 发酵液的预处理的常用方法主要是在发酵液中加入絮凝剂，常用的絮凝剂有： 聚丙烯酰胺（Polyacrylamide） 磺化聚苯乙烯（Polystyrene Sulfonate）； CH 4.1 酶制剂的工业提取方法3 酶蛋白的初步纯化与浓缩 3.1 盐析法 　[1] 盐析的基本原理： 　　 蛋白质在水中的溶解度与其所带净电荷的多少呈正相关，即蛋白质的极性越强，其溶解度越大，溶液中的离子与蛋白质分子争夺水分，从而减弱蛋白质的水合程度，降低其溶解度； 另一方面，液相中离子的电荷部分地中和蛋白质分子上的电荷，使其净电荷降低或净电荷消失，促使蛋白质析出； 此外，溶液中的盐离子引起水分子的极化和定向排列降低水分活度；以上三方面的作用，使可溶性蛋白在水溶液中析出。 CH 4.1 酶制剂的工业提取方法3 酶蛋白的初步纯化与浓缩 3.2 有机溶剂沉淀法 除用盐析法沉淀酶蛋白外，还可以用有机溶剂沉淀酶蛋白，目前选用的有机溶剂主要有丙酮和乙醇，并且丙酮的沉淀效果比乙醇好，但丙酮的价格高，蒸馏回收困难，所以目前多采用乙醇作沉淀剂。 沉淀酶蛋白所需乙醇浓度受很多因素影响，溶液的离子强度、温度、pH值等都影响蛋白质的析出，低浓度的盐离子有促进蛋白质溶解的作用，即所谓的盐溶效应；所以当溶液中有低浓度盐离子时，乙醇的浓度要增加；温度升高蛋白质的溶解度增加，沉淀酶蛋白需要的乙醇浓度增加；pH值的影响因不同的蛋白质而不同，一般情况下，当溶液的pH值与酶蛋白的等电点一致时，需要的乙醇浓度最低，偏离酶蛋白的等电点越远，酶蛋白所带电荷越多，蛋白质的溶解度越大，沉淀蛋白所需乙醇浓度越高。 CH 4.1 酶制剂的工业提取方法3 酶蛋白的初步纯化与浓缩 3.3 喷雾干燥法 此法是利用喷雾干燥技术，直接将液态酶浓缩成固体酶制剂，此法的生产效率较高，工艺过程简单，但此法在生产应用上有一定的局限性，在喷雾干燥时，需要一定的温度，在喷雾塔里面进如一定温度的热空气，对于那些对热不稳定的酶蛋白不宜使用，现用在生产的主要是生产α-淀粉酶。 CH4-2酶蛋白的提纯与精制 一般情况下，工业上用的大多是经过初步提纯和浓缩即可制备成酶制剂；对于多数医用酶制剂或分析用酶制剂或生化试剂等，则需要进行高度提纯和精制；另外对于开发出的新的酶制剂，在投入规模化生产前，为研究其各种酶蛋白特性和酶学特性，也需要将酶进一步提纯和精制。 酶蛋白提纯的经典程序包括： 离子交换层析——分子筛过滤层析——电泳检测纯度（必要时可进行制备电泳分离） CH4-2酶蛋白的提纯与精制1 离子交换层析法 （1）离子交换剂：离子交换剂是借酯化、氧化或醚化等化学反应，在琼脂糖、纤维素或凝胶分子上某些极性基团，通过极性基团的静电吸附作用，对极性大分子进行分离。 按离子交换剂上的活性基团的性质不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两种。 CH4-2酶蛋白的提纯与精制1 离子交换层析法 （2）离子交换分离酶蛋白的基本原理： 一般情况下，酶蛋白的等电点在pH7以下，所以在偏碱性溶液中，酶蛋白带负电荷，所以多用阴离子交换剂；（有些酶蛋白等 电点较高，可以将其置于偏酸性溶液中，这样酶蛋白就带正电荷，分离纯化时应选用阳离子交换剂）。 在同一pH条件下，由于不