Sp1（530-623）锌指蛋白（三个锌指结构域）的表达与纯化.doc

Sp1（530-623）锌指蛋白（三个结构域）的表达与纯化 撰写人：陈思明 2013-04-19修订人： 准备： 质粒：SG1-Sp1(530-623) 金属（Ni柱）螯合树脂（每升表达液需要3 ml 树脂） 相关缓冲液 Resuspend Buffer 20 mM Tris, pH=7.4, 500 mM NaCl, 8 M urea Wash Buffer Resuspend Buffer + 20 mM immidazole; Elution Buffer Resuspend Buffer + 500 mM immidazole; 表达条件： 质粒抗性 氨苄 50 (g/ml 表达菌珠 BL21(DE3) 诱导温度、OD600 37℃；OD600=0.8至1 IPTG浓度、诱导时间 优化后采用0.8 mM；诱导4 hours 纯化步骤：（以1L 菌液为例）（详见陈思明实验记录2009年11 月22日，第一本实验记录本） 收菌：4000 rpm ( 20 min 破碎菌液：超声或压力（30%功率 8 min 超声即可） 【注：1L的菌液收集的菌体重悬于20 ml的Resuspend Buffer，超声后包涵体维持在Resuspend Buffer中1h左右，以保证目的蛋白完全溶解】 离心：16000 rpm ( 30 min;留上清，过0.45uM滤膜； 【注：由于包涵体处理直接过0.45uM较难通过，浪费滤膜，可以依次用1.2 (m, 0.8 (m, 0.45 (m的滤膜，效果较好！】 结合树酯（预先用Resuspend Buffer平衡）： 【注：如果树酯是刚从20%乙醇中取出，用超纯H2O洗3-5次，随后平衡10 min】 将上清（大约20 ml左右）与3ml预平衡的树酯混合，放置4℃ 旋转混合仪上，结合时间30 min,随后放掉上清； 洗涤杂蛋白： 加入20 ml Wash Buffer于Ni柱，并使其慢慢滴下，洗涤时间15 min； 【注：保证洗涤时间不要低于15 min，洗涤过程要保证Ni柱始终处于Buffer条件，不要让Ni柱处于干燥状态】 洗脱目标蛋白： 加入15 ml Elution Buffer, 放置4℃ 旋转混合仪上30 min，收集洗脱液，并再次用10 ml Elution Buffer洗Ni柱上残留的目的蛋白。 树酯再生： (1) 先用水清洗2次，除去Ni柱上的尿素； (2) 用20 mM MES (pH 5.0) 在旋转混合仪上处理20 min，随后用水清洗3-5次； (3) 如果树酯长期不用，用20%乙醇保存Ni柱； 蛋白复性 (参考蛋白变复性方案) 透析外液的组成为200 mM NaCl, 5 mM 柠檬酸钠, 10 μM ZnCl2, 5 mM β-ME，20 mM Tris, pH 7.4 透析过程中尿素的浓度采用： (a)第一步：外液中含有4M尿素，4度搅拌透析12小时（一般过夜）； (b)第二步：外液中含有3M尿素，4度搅拌透析4小时， (c)第三步：外液中含有2M尿素，4度搅拌透析4小时； (d)第四步：外液中含有1M尿素，4度搅拌透析4小时 (e)第五步：外液中不含尿素，4度搅拌透析12小时； (f)第六步：重复第五步透析一次。 TEV酶切 酶切实验中，一般用TEV/Sp1(530-623)体积比为1:10来完成酶切过程。 1L LB培养基可以获得25mlTEV蛋白酶再加上等体积甘油，混匀后，分管分装，-80度冻存备用； 酶切电泳鉴定结果见图1 图1?：SDS鉴定TEV酶酶切Sp1(530-623)蛋白的N端His标签 分子筛纯化 将Sp1(530-623)前体蛋白的酶切体系，经过超滤杯适当浓缩后，再用分子筛纯化，其分子筛纯化的色谱结果参见图2。在80 ml出水体积处有一明显的紫外吸收峰，其表观分子量与Sp1(530-623)蛋白分子量基本上吻合； 图2：分子筛纯化Sp1(530-623)蛋白色谱图 Sp1(530-623)蛋白通过脱盐过程换成如下buffer（50mM HEPES, 100mM NaNO3 pH6.8）。 完成buffer更换，UV定其浓度后，分管分装，500μl/管，-80度冻存备用 每次使用时候，取出来1支在4度条件下解冻； 稳定性问题 Sp1蛋白比较稳定，-80冻存可以保存3个月的蛋白样品，没有问题，更长时间也没做过。 室温条件下比较稳定，两三天不会有问题，更长时间没有做过。 含Zn2+的蛋白不能冻干保存，因为无论是单个锌指还是三个锌指的蛋白冻干后，再溶解都会出现沉淀情况，故不建议冻干保存； 如果确实需要冻干操作，可以选择Apo态蛋白，但是在重构锌指过程，需要加入还原剂TCEP或DTT，并加上Zn2+（Zn