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分子生物学研究方法和技术 湖南省农业生物技术研究中心 詹 庆 才 电话Email:zhanqc@ 本人基本情况 1984年获湖南农学院农学学士学位。1987年获中国科学院遗传研究所理学硕士学位，专业:分子遗传。 1999年11月-200２年11月 受国家科技部派遣，在日本农林水产省北海道国家农业研究中心博士后特别研究员；主要从事基因定位和功能基因的筛选。 １９８４－１９９９年：主要从事水稻细胞质雄性不育机理研究；水稻分子育种技术研究。 １９９９－２０１4：主要从事杂交水稻种子纯度快速鉴定技术研究；水稻品种ＤＮＡ指纹研究；基因定位和分子育种技术研究。  1、分子生物学的发展历程 1871年，首次发现DNA（鲑精DNA）。1943年，证明DNA为遗传分子，而不是蛋白（1944，O T Avery） 1953年，DNA双螺旋模型提出（J D Watson（美）和F H C Crick（英），1962年或诺贝尔生理学、医学奖）。从而为分子生物学这一学科奠基。1961年，合成mRNA，破译第一个遗传密码（M W Nirenberg（美），1968年获诺贝尔生理学、医学奖）——基础研究的创新，与推动人类文明的进步。（以上被称为理论上的三大发现） 1970年，分离出第一个限制性内切酶（W Arber（瑞士），1978年获诺贝尔医学奖） 1970年，Baltimore和Temin发现了逆转录酶 ——长期的基础研究积累迎来了突飞猛进的高潮。 1973年，Cohen把质粒作为基因工程的载体使用 ——基础研究向应用研究的拓展。 （以上被称为生物工程技术的的三大发明） 3个事例： （1）1976年，重组DNA成功（H Boyer和S N Colen，1981年获诺贝尔化学奖）——勇敢的科学精神。 （2）1982年，美国一制药公司在2000升发酵液中提取出100克精制胰岛素。相当于从1600磅动物胰腺中的提取量——效率、成本、质量、竞争。 （3）荷兰最早把分子生物学产品“猪牛痢疾疫苗”投放市场，比以上美国的胰岛素早半年——后来居上。 人类对生命现象的认识 20世纪 个体 → 染色体 → 基因 →DNA → SNP 生物与非生物间的界限消失了！ 21世纪 基因克隆，拼结 → 组装植物、动物、婴儿！ 2.4 分子生物学发展的三大支撑学科 第一章 RNA的分离纯化 主要内容 前言 一、核酸分离、纯化原则 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 （二）防止核酸的生物降解 二、分离提取核酸的主要步骤 （一）细胞的破碎 （二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 （三）核酸的沉淀 (四）核酸的浓度测定 （五）核酸的保存 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。 一、核酸分离、纯化原则 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 1 意义 遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 2 分离核酸原则： 1）温度不要过高； 2）控制一定的pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定的离子强度; 4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力. （二）防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 1. DNA酶抑制剂 1） 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； 2） 阴离于型表面活性剂： 如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。 2. RNA酶（RNAase)抑制剂 RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。 (2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意： 1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。 2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器