9.高效液相色谱试卷.ppt

1.高效液相色谱法定义 2.高效液相色谱法与其他分离方法的比较 1.化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相 a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； 三、 液-液分配色谱 第四节 高效液相色谱仪 (2) 脱气装置流动相为什么要脱气 流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。 气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。 气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。 气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。 溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。 氧气使荧光消光。 脱气方法　　 离线超声波振荡脱气和在线真空脱气。a. 超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min。 这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，所以，目前仍广泛采用。 b. 真空脱气装置 将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。 一般的真空脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。 (3) 梯度洗脱（类似GC中的程序升温） 为什么要进行梯度洗脱？　　在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。 为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。 梯度洗脱操作　　在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。 低压梯度混合就在比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。 (6) 检测器 b. 荧光检测器（Fluorescence detector） D.示差折光检测器 (RID) 又称折射率检测器。原理：基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。 绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以RID是一种通用型的检测方法。 虽然其灵敏度比其他检测方法相比要低1-3个数量级。对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。 在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。 E.蒸发散射光检测器（ ELSD） 　　ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器。由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光检测器（光电转换器）等部件构成 色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质， 激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。 因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。 适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。 流动相必须是挥发的，不能含缓冲盐类等。 液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 流动相输送系统参数：流速 固定相：色谱柱类型及内径、长短 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件 （4）色谱柱： GC填充柱1~6m，毛细管柱20~100m，螺旋型； HPLC 15cm或25cm，直型。 (5)分离效率不同 HPLC：大于3万塔板/米 （GC：103塔板/米） 思考题 1.什么是化学键合固定相,它的优点是什么? 2.正相色谱、反相色谱和梯度洗脱的定义. 3.高效液相色谱对流动相有哪些要求? 4.高效液相色谱与气相色谱的区别与联系 (5) 高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm（常用4.6mm或3.9mm），柱长5～40 cm（常用15cm或25cm）。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 与GC色谱柱不同。 a. 紫外检测器 对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围大； 流通池可做得很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操