环介导等温扩增技术对锦鲤疱疹病毒的快速检测.docVIP

环介导等温扩增技术对锦鲤疱疹病毒的快速检测 　　摘 要：为建立一种快速检测锦鲤疱疹病毒（CyHV-3）的环介导等温扩增方法（LAMP），本研究根据GenBank中登录的CyHV-3 TK基因编码区序列设计了LAMP特异性引物，通过优化反应条件，建立了检测CyHV-3的LAMP方法。表明本实验建立的该检测方法具有高灵敏度、高特异性、快速和简便的特性，适用于临床上对锦鲤疱疹病毒3的快速诊断。 　　关键词：LAMP；CyHV-3；快速检测 　　0 引言 　　锦鲤疱疹病毒病是由鲤疱疹病毒3型Cyprinid herpesvirus 3（CyHV-3）感染引起鲤鱼、锦鲤以及普通变种鳃坏死和间质性肾炎的一种高致病性、高传染性、高死亡率疾病。现已在全世界范围内流行，严重威胁着鲤鱼和锦鲤养殖业的发展。 　　目前，已经建立的对CyHV-3的检测方法有DNA杂交、PCR、套式PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增方法（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）等。以上检测方法在临床检测中均存在局限，如仪器设备，技术人员和成本等。LAMP检测方法对仪器要求低，根据颜色变化通过肉眼可以对结果进行判断，适用于现地检测。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要实验材料 　　含有CyHV-3 TK基因的重组质粒，Bst DNA聚合酶（长片段）、Thermopol II反应缓冲液，SYBR Green I荧光染料，Betaine，dNTP，DNAMarker，病毒DNA提取试剂盒， 　　1.2 引物设计 　　根据中华人民共和国水产行业标准中，鲤疱疹病毒检测方法要求的CyHV-3的TK基因的序列，使用Primer Explorer V4设计8条特异性引物（表1），并交由上海生工合成。 　　1.3 LAMP扩增 　　LAMP反应体系：1μl F3/F3’（10μM），1μl B3/B3’（10μM），1μl FIP/FIP’（50μM），1μl BIP/BIP’（50μM），4μl dNTPs（25mM），4μl 10xThermopol buffer，8U BstDNA聚合酶，3μl Betaine（0.8M），2.5μl MgCl2（25mM），2μl模板DNA和4.5μl ddH2O，石蜡密封液面，之后加入2μlSYBR Green I，65℃孵育60min，80℃10min灭活酶终止反应。 　　反应管淡绿色为阳性，淡橘黄色为阴性。结果判定采用琼脂糖凝胶电泳检测。 　　1.4 LAMP反应条件优化 　　分别通过不同温度以及不同时间进行LAMP扩增，优化dNTPs、Betaine、MgCl2等其他反应条件。 　　2 结果 　　LAMP的建立和检测：以特异性引物对CyHV-3进行LAMP扩增，肉眼观察，CyHV-3阳性管浑浊.而阴性管未见浑浊，加入荧光染料SYBR Green I后，CyHV-3阳性管反应液变为淡绿色，而阴性对照管为棕色。 　　琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，CyHV-3阳性管出现典型的梯形条带，而阴性管没有产生条带。 　　经优化后，LAMP体系最佳反应时间为40min，最佳反应温度为65℃，dNTPs最适浓度为1.2mM、Betaine最佳浓度为0.8mM、MgCl2最佳浓度为8mM。 　　3 讨论 　　自从锦鲤疱疹病毒发现以来，各个地区几乎每年都有流行。目前，锦鲤疱疹病毒病的全球性暴发，给锦鲤观赏业、鲤鱼养殖业以及国际贸易造成了严重的经济损失。 　　PCR是目前较为精确检测CyHV-3感染的方法。Bercovier等基于CyHV-3的胸苷激酶基因建立的PCR方法，能够区分CyHV-3与CyHV-1和CCV。刘荭等建立了nestedPCR，已作为我国检测CyHV-3的标准方法。范万红等建立的实时荧光定量PCR缩短了检测时间，适用于进出口检验检疫。LAMP法是一种新式恒温核酸扩增方法，该扩增法具有简便、快速、准确、廉价、易检测等特点。Gunimaladevi等基于TK基因设计引物，建立了快速检测CyHV-3的LAMP法。Soliman等在产物中加入SYBR GreenⅠ，根据其颜色的变化来判定结果，从而更加直观。LAMP检测法不需要特殊的仪器设备，适合现场诊断。因此LAMP法具有良好的应用前景。 　　本实验建立的LAMP方法具有以下特点：第一速率快，仅40min左右即?_到反应的平台期；第二、对反应装置要求较低，恒温水浴锅、PCR仪均能作为LAMP的恒温反应装置；第三、结果观察简单，添加SYBR Green I核酸染料后肉眼即可观察。本文提供了稳定的CyHV-3检测体系，为控制CyHV-3的流行与及时检测提供了技术支持。 　　致谢 　　本研究由河北省