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萍乡地区RhD阴性人群基因多态性分析 　　Rh血型系统是红细胞血型系统中最为复杂的血型系统之一，具有复杂的遗传多态性，其临床意义仅此于ABO血型系统。Rh血型系统目前已发现49种抗原，以C、e、D、E、e这5种抗原在临床上最为重要，尤其是D抗原，它是除ABO血型系统外最强的红细胞抗原，具有极强的免疫原性，是造成迟发性溶血性输血反应最常见的原因[1]。因此，鉴定RhD抗原表型被列为临床输血检测常规项目[1]。编码Rh血型抗原为2个高度同源性的基因：RhD基因和RhCE基因。RhD编码D抗原，RhCE编码CcEe抗原。近年来，有些研究发现一些血清学初筛阴性的个体经进一步检测，发现一部分人有D抗原的存在。因此，为了解萍乡地区Rh阴性人群基因多态性状态，经序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）方法进行基因学检测，比较血清学结果与基因学结果的异同。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 收集我院2011年5月～2015年1月住院及门诊患者2035例标本进行了RhD抗原检测，RhD阴抗原性率为0.88%[2]，对130例RhD阴性标本进行了检测，其中男性60例，女70例，年龄20～75岁。标本为采用EDTA抗凝的全血3 ml。 　　1.2仪器与试剂 美国ABI 9700 PCR扩增仪，Thermo离心机。Alphalmager凝胶成像系统，Tanon EPS 300电泳仪，紫外分光光度计，日本富士DNA提取试剂盒，天津秀鹏生物技术有限公司的RhD基因检测试剂盒，江阴力博医药生物技术有限公司的RhD血型定型试剂。 　　1.3方法 　　1.3.1 RhD血型血清学鉴定 将血样混匀洗涤3次，配成5%红细胞悬液，取1滴加入试管中，再向试管中加入2滴IgG的抗D试剂，37℃孵育30 min。然后用生理盐水反复洗涤3次，弃上清液，再加入广谱抗人球蛋白试剂，1000 r/min离心1min，观察结果。有凝集者为RhD阳性，无凝集者为RhD阴性。 　　1.3.2 RhD血型基因学检测 　　1.3.2.1基因组DNA提取 采用日本富士DNA提取试剂盒提取基因组DNA，严格按说明书操作，紫外分光光度计检测OD26010D280，以确定DNA浓度及纯度，将提取好的DNA置于-20℃冻存备用。 　　1.3.2.2 PCR-SSP 采用天津秀鹏生物技术有限公司的RhD基因检测试剂盒，扩增参数为96℃ 2 min，1个循环；96℃20 s 68℃ 1 min，5个循环；96℃ 20 s 65℃ 50 s 72℃ 45 s，18个循环；72℃ 5 min，1个循环；4℃保存。 　　1.3.2.3电泳及结果判读 将上述扩增产物5～10 ul转移到2.5%琼脂糖凝胶孔中，140～150V电泳，10 min后于Alphaimager凝胶成像系统下观察结果。865 bp为内参带，另一条为特异性扩增带，有特异性扩增带判断为阳性，无特异性扩增带判断阴性。 　　2结果 　　130例RhD阴性标本中，经PCR-SSP方法检测，10例1227DEL型，119例RhD-CE（2-9）-D型，1例弱D15型。 　　3讨论 　　Rh血型基因位于人类第1号染色体断臂34.3～36.1区域。由RhD基因和RhCE基因紧密串联排列组成。RhD基因和RhCE基因高度同源（93.8%）均有10个外显子和9个内含子，长度分别为57932 bp和58575 bp，均编码417个氨基酸。两者的第8个外显子完全相同，差异较大的是外显子3、4.5、7、9和内含子。 　　RhD抗原表型除了正常的D阳性和阴性表型外还存在多种D变异表型。这种RhD变异体的形成涉及复杂的分子生物学变化，主要为RhD和RhCE等位基因发生融合、细胞外环错义突变，外显子缺失和等为基因被错换等。D变异体主要包括弱D（weakD）、部分D（partialD）和DEL型。弱D抗原表达完整但是强度减弱，由基因编码区碱基突变造成。中国人群中最为常见的是弱D15。此外，亚洲人群中还分布弱D1型、弱D24型、弱D6型。弱D12型和弱D17型等。部分D抗原表达不完整，其质量发生变异，与某些抗D试剂不发生凝集反应。中国人群中弱D以RhD-（2-9）-D2等为基因为主。DEL表型比例较高。各种族人群DEL表型的分子机制也不尽一致。中国人DEL分子机制主要有外显子9缺失和RhD1227A两种。 　　本研究通过对130例Rh阴性标本同时进行血清学检测结果均为Rh阴性，但基因学结果却有一定的差异，其中检出10例1227DEL型，119例RhD-CE（2-9）-D型，1例弱D15型.。由此可见，血清学检测Rh血型的方法快速简便，但确实存在一定的漏检率。为了避免在血清学上RhD变异体被误定为RhD阴性，采用DNA分型技术来