第5章细胞融合规范.ppt

第五章 细胞融合 一 细胞融合的定义 细胞融合是20世纪60年代发展起来的一项细胞工程技术。细胞融合(Cellfusion)又称体细胞杂交(Somatic hybridization)，是指将不同来源的原生质体(除去细胞壁的细胞)相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。 二.细胞融合的意义 1.通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。可把这种技术应用于遗传性状改良、克服远缘杂交中的不亲和障碍、更加广泛地组合起各种植物的优良遗传性状，从而培育出理想的新品种。 2.进行体细胞融合可以避开生殖细胞的受精过程，从而在亲缘更远的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没有的新物种。 3.体细胞融合还有一个重要的价值，就是创造细胞质杂种。在体细胞杂交中双亲的细胞质都有一定的贡献。据试验，融合后的杂种细胞质最终会选择某一亲本的叶绿体，但线粒体可以实现双亲重组。因此，有可能通过细胞融合获得细胞核、叶绿体、线粒体基因组的不同组合，这在育种上无疑有着重大价值。 4.体细胞杂交在作物育种和种质创新上有其独到的意义和作用。随着新的融合技术(如电融合技术)进一步完善和发展，体细胞杂交对作物改良必将发挥出更大的作用。 三 基本原理 对于植物细胞而言，　　　　　　　　　　　1、一般先将两种不同植物的体细胞(来自其叶或根)经过纤维素酶、果胶酶消化，除去其细胞壁，得到原生质体；　　　　　　　　　　　　２、而后通过物理或化学方法诱导其细胞融合形成杂种细胞；　　　　　　　　　　　　　　　３、继而再以适当的技术进行杂种细胞的分检和培养，促使 杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直至形成杂种植株，从而实现基因在远缘物种间的转移。　　　　　　　　　　　　　　　４、由于这个新细胞得到了来自两个细胞的染色体组和细胞质，在适宜的条件下来培养，长成的生物个体就是一个新的物种或品系。 下图所示的是两个不同的原生质体或细胞融合成一个新的融合细胞的原理示意图：将不同来源的两个原生质体或细胞通过细胞融合，得到含有两者遗传信息的新的杂合细胞，然后通过培养基筛选出这种杂合细胞，就有可能得到一个新生物。 植物细胞融合过程示意图: 显微镜下的细胞融合过程见图5-2 细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核融合几个步骤。其中细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步，融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的具体变化过程图解如图5-3所示。 细胞融合现象最初是在动物细胞中发现的。 后来，细胞融合技术逐步扩展到植物细胞和微生物细胞。 四 融合材料 （一）植物或微生物原生质体的制备 植物和许多微生物细胞外有一层坚韧的细胞壁，如植物细胞质膜外面包裹一层细胞壁，各细胞壁间有果胶层将细胞联结在一起。为了促使这样细胞的融合就必须先得到单个细胞，除去细胞壁，才能获得植物原生质体或微生物原生质球。因此对于植物和微生物细胞的融合一般又可称为原生质体融合。 （二）动物单个细胞的获得 动物细胞虽然没有细胞壁，但细胞间的连接方式多样而复杂，在进行有效的细胞融合之前，也必须获得单个分散的细胞。主要步骤如下： 1. 组织的获得 采用各种适宜的方法处死动物，取出组织块放入小烧杯中，用剪刀将组织块剪碎成lmm3大小，用吸管吸取Hanks溶液冲下剪刀上的碎块，补加3-5ml的Hanks溶液，用吸管轻轻吹打，低速离心，弃去上清液，留下组织块。 2.组织的消化 通过生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。可根据不同的组织对象采用不同的酶消化液，如最常用的有胰蛋白酶和胶原酶等。其他的酶如链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物组织的消化。EDTA最适合消化传代细胞，常与胰蛋白酶使用。 下面分别以胰蛋白酶和胶原酶为例介绍一下动物组织的消化方法： 胰蛋白酶：尤其适合于细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾以及传代细胞等。用胰蛋白酶消化动物细胞的基本步骤如下： (1)向剪碎的组织块中加入30-50倍体积的0.25％浓度的胰蛋白酶。 (2)在37℃水浴内消化30~60min，每5-l0min摇动一次，根据具体情况可以中间更换消化液。 (3)Hanks液漂洗两次，每次2~3min 。 (4)800r／min离心5min，弃上清液，加入营养液。如果有大块，可用纱网过滤。 胶原酶：是一种由细菌中提取的酶，对胶原和细胞间质有较强的消化作用，适用于消化纤维组织、上皮组织、癌组织等。胶原酶不受Ca 2+、Mg2+的螯合影响，可