新兴猪IFNα1成熟蛋白基因的克隆与序列分析.pdf

中国畜牧兽医学会生物制品学分会第十次学术研讨会论文集 ·微生物与分子生物学研究· 新兴猪IFN—al成熟蛋白基因的克隆与序列分析+ 陈瑞爱，温纳相，裴仉福，唐满华，金晓芹，魏志清，朱文冠 (广东大华农动物保健品有限公司，广东新兴527439) [摘 要】 为研究和开发猪a一干扰素(Interferon—alpha，IFN—a)生物工程制剂，本研究根据NCBIGenBank上登载的猪 GenBank上登载 pMDl8一T载体，经PCR、酶切及序列测定表明，克隆片段由501个核苷酸组成，共编码166个氨基酸，与NCBI 开发猪干扰素制剂，有效控制猪病具有一定的重要意义。 [关键词】IFN—a基因；克隆；序列分析 IFN—a因具有显著抗病毒功能而被广泛应用于病毒性疾病的治疗和防治，IFN—a是一种具有抗病毒、 抗肿瘤和免疫调节等作用的细胞因子，主要由激活的T和NK细胞产生，在机体免疫系统中发挥重要作 用L1,21。IFN—a的作用机理是通过抑制病毒复制和调节机体免疫功能，从而发挥抗病毒作用，对多种病毒性 疾病都有很好的抗病效果。猪IFN—a含有一个由570 bp组成的开放阅读框，编码含189个氨基酸的多肽， 其中23个氨基酸为信号多肽，成熟蛋白质由166个氨基酸组成；我国是养猪大国，而猪的病毒性疾病种类 多、危害大，其流行特点是病毒变异快，非典型，易暴发；因此需要具有广谱、高效抗病毒的干扰素类生物制剂 J 来治疗和加强免疫效果，对预防和治疗猪的传染病具有重要意义HIs]。 1材料与方法 1．1试验动物3周龄新兴仔猪，由温氏集团良洞猪场提供。 DH5a受体菌为本室保存。 1．2质粒载体和菌种pMDl8一T为TaKaRa公司产品，E．coli Marker 1．3工具酶和生化试剂限制性核酸内切酶XbaI和Hind DNA聚合酶、DNADL2000、入一 III、Taq HindIII DNA digest为TaKaRa公司产品；E．Z．N．A．Tissuekitll核酸抽提试剂盒、PCR产物凝胶回收试剂盒、质 Bio—tek公司产品。其它试剂均为分析纯试剂。 粒回收试剂盒为Omega 1．4引物设计与合成根据NCBI 亚生物技术有限公司合成)，引物序列如下： 上游引物P1为：57一TGGAATrCTGTGACCTGCCTCAGACCC一3’ 下游引物P2为：5’一CGTCTAGATCACTCCTTCrITllCCTGAGTC一3’ Bio—tek公司的E．Z．N．A．Tis． 1．5基因组DNA提取无菌采取猪肝组织，提取猪肝细胞DNA(参照Omega sueDNA kitⅡ核酸抽提试剂盒说明书)。 1．6 dNTP PCR扩增在25td的反应体系中加入10xBuffer2．5td，10mmol／L1弘l，P1、P2各30pmol，模板DNA 5td及Taq酶0．5灶l，加水至25／11。PCR反应条件为：94。C 循环，最后72℃延伸10rain。扩增结 束后取5越lPcR产物进行电泳检测。 1．7基因克隆PCR产物经10异／L琼脂糖凝胶电泳，回收500 bp处的条带，连接到pMDl8一T载体，转化DH5a *作者简介：陈瑞爱(1970一)，女，广东省新兴县人，高级兽医师，硕士 of o