新型血脑屏障模型的建立一种新型微孔底膜插入式培养皿的制作方法.pdf

新型血脑屏障模型的建立 一种新型微孔底膜插入式培养皿的制作方法 1 1 2 赵康峰 ,蒲小平 杨秀伟 1北京大学药学院分子与细胞药理学系 北京1000832天然药物及仿生药物国家重点实验室 北京100083 血脑屏障 Blood Brain Barrier, BBB 是由脑微血管内皮细胞 星形神经胶质细胞足突和基底膜 组成的一个复杂系统 脑微血管内皮细胞是组成血脑屏障的基本骨架 它与外周血管内皮细胞相比 在形态和功能上有其特殊性 血脑屏障将中枢神经系统和血液系统隔离开来 防止血液中有毒物质进 入脑内 维持中枢神经系统的正常功能 但同时也限制中枢神经系统药物进入大脑 在研究药物跨血 脑屏障转运机制中需要建立新型血脑屏障模型 我们通过 脑毛细血管内皮细胞的分离培养; 星状 胶质细胞的分离培养; 共同培养三个步骤 建立新型体外血脑屏障模型 微孔底膜插入式培养皿是建立体外血脑屏障模型 in vitro Blood-Brain Model, BBBM 的核心部 件 因其购买费用高且不可重复使用和不可调节性 一直是制约国内研究人员向这一领域深入研究的 瓶颈 而在药物跨血脑屏障转运机制的研究 评价药物跨膜通透率及中枢神经系统(CNS)靶向给药方 法的研究中 需要稳定性好 能够进行调节 可重复使用的微孔底皿 本文总结了我们自行制备一种 微孔底膜插入式培养皿的方法 1 材料 Millicell ERS电阻测量系统 MILLIPORE公司 CO孵箱 德国HERAEUS公司 倒置生物显 2 微镜 日本NIKON公司 直径12㎜插入式Millicell培养皿 法国 0.22m孔径 和0.45m孔径 纤维素酯胺微孔滤膜 上海兴亚 细胞培养试剂 略 Rabbit Anti-GFAPF- 相关抗原抗体 中 山公司 以及免疫组化SABC试剂盒 BOSTERSD大鼠购自北京大学医学部实验动物中心 2方法 2.1微孔底膜插入式培养皿的制备过程 从冻存管旋盖端1.24㎝处横切 得一圆环备用 从旋盖顶端中心穿孔 孔径大小保持与旋盖垫 圈内径相同 将处理好的滤膜制成直径1.22㎝的小滤片 蒸馏水中浸泡30min 填装滤片 将1.24 ㎝内套环旋入拧紧 检查其完整性 高压灭菌 15磅 15min适合于标准24孔或6孔培养板使用 1 2.2 细胞分离培养 脑毛细血管内皮细胞的培养采用 J.Abbott的方法 略有改动 脑星形胶质细胞的培养参照 McCarthy方法 并稍加改良 2.3 免疫细胞化学 室温固定细胞 加含0.3% HO的PBS反应30min滴加一抗 RabbitAnti-GFAP1 100F- 2 2 Related Antibody1 200,4过夜;PBS漂洗后 滴加生物素标记二抗,37反应1h滴加辣根酶 HRP标记链霉卵白素工作液 37 30min加DAB显色 在显微镜下观察染色情况 以出现阳性 而背景未着色为准 终止反应 中性树胶封片 观察 记录 2.4 鼠尾胶原制备及覆被 2 鼠尾胶原由本实验室自制 覆被方法 以40 l/㎝ 包被瓶/皿 37 保持数天使覆被面干燥 接 种细胞前不再做任何处理 2.5 星形胶质细胞条件培养液的收集及其总蛋白含量的测定 测定星形胶质细胞条件培养液中蛋白含量可为脑毛细血管内皮细胞和星形胶质细胞接触共培养 时生长培养液的选择提供依据 原代细胞长满瓶底时 进行传代 培养2d 后换成无血清DMEM/F12 培养液 继续培养48h, 收集此培养液 离心1000rpm 15min 留取上清 即为星形胶质细胞条件培 养液 总蛋白含量测定 采用改良Lowry 法 配制6 种标准浓度的BSA 溶液 以空白管作对照 用 分光光度计650nm波长下测定各管的光密度 OD值 将条件培养液稀释成样品