9第九章_目的基因的表达选编.ppt

* * 第九章 目的基因的表达 遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（central dogma）。 一、基因表达： 二、克隆基因的表达： 外源基因在宿主细胞中表达。 宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。 用原核生物细胞作宿主。 A dividing E. coli 三、 外源基因在原核细胞中的表达 原核或噬菌体启动子 MCS SD序列 终止子 识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。 数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。 （一）原核生物基因表达的特点 2. 以操纵子为单位 1. 只有一种RNA多聚酶 3. 转录和翻译偶联、连续进行。 核糖体 4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。 5. 调控主要在转录水平上。 含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。 6. mRNA的核糖体结合位点 Shine-Dalgarno（S-D）sequence: （二）原核表达系统的注意事项 外源基因不能带有内含子。 2. 必须用cDNA。 3. 不能直接用真核基因组DNA。 4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等） 5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。 （三）原核生物基因表达的调控 1. 启动子 -35 Box 和 -10 Box （1） 启动子序列 consensus sequences （2）翻译的起始位点 ①核糖体结合位点（ RBS） 1）SD sequence： mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。 ribosome binding site SD mRNA 5’—AGGAGGU——AUG—— 16S rRNA3’ UCCUCCA S-D序列距离AUG的距离也影响翻译 AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%） 位于SD序列下游。 2）起始密码： 全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2两个大亚基（β和β′），一个σ亚基。 2. RNA聚合酶 大肠杆菌只有一种类型的RNA聚合酶转录tRNA，rRNA和mRNA。 （1）结构 3. 转录终止子 内终止子 intrinsic terminator： E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。 在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。 启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子 由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。 原因： 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作 ① 茎环结构 ② 多聚A/U 大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。 4. 翻译终止密码 5. 翻译增强子 Translation enhancer 能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。 ① 必须是一种强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。 ② 应呈现低水平的基础转录 便于表达毒性蛋白等。 ③应是可诱导型的 用温度或化学试剂诱导。 （1）最佳启动子必须具备的条件 6. 基因工程常用的原核启动子 （四）外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 1. 细胞质中表达 （1）包涵体（inclusion body） 是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。 形成原理未知。 在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（human growth hormone, hGH）。 例： 使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞 回收的蛋白生物活性差。 ② 缺点 ① 优点 2. 周质中表达 （1）周质（periplasm） 格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚 优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。 能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。 （2）信号肽（signal peptide） 一般位于N端。 由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。 用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白； 使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。 3. 胞外表达 或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。 5’-TTGACA-3’ 5’-TATAAT-3’ ① -35box ②