核糖核酸与夜蓝作用机理及含量测定.pdf

2006年11月 第四届海峡两岸分析化学学术会议论文集 湖北·武汉 核糖核酸与夜蓝作用机理及含量测定 张东辉，訾言勤+，陆丽园 (淮北煤炭师范学院化学系，淮北235000) 摘要：在弱酸性介质中，小分子夜蓝与生物大分子核糖核酸(RNA)强烈相互作用，导致分子构象 的变化，引起分子光谱最大吸收波长和吸收值的变化。研究了反应体系酸度、夜蓝用量、反应时 间等影响反应速度的因素，确定了最佳实验条件，建立了测定核糖核酸的新方法。线性范围为 0．4～7．2 凝聚在RNA分子链上的反离子交换，然后以协同方式与RNA分子发生键合，使夜蓝的丌电子叠 合程度降低，颜色变浅，吸收值降低，最大吸收波长紫移。 关键词：核糖核酸；夜蓝；分光光度法；静电缔合 核糖核酸(RNA)具有储存、传递信息和催化等功能，近年来受到化学、生物和医药等诸多学 科的极大关注，是生命科学研究的重点和热蒯¨。小分子配体同生物大分子的作用是研究生命现 象和药物作用机理的一个基本问题，RNA的研究成果将成为制服病毒和癌症的有力工到引。建立 阳离子染料作用机理对揭示RNA与阳离子染料作用的物理化学本质，改进生理学中基因传输载 体，提高转染效率十分重要。由于DNA是双螺旋结构，RNA常为单链结构，与某些阳离子染料的作 用表现不同的光谱行为。实验表明，夜蓝与RNA作用使夜蓝显著退色，由此建立了测定RNA的 新方法。本方法简便、快速，具有较高的灵敏度，应用于样品分析获得了满意结果。其作用机理 为：静电缔合作用使夜蓝分子与凝聚在RNA分子链上的反离子交换，然后，以协同方式与RNA 分子发生键合，使夜蓝的Ⅱ电子叠合程度降低，颜色变浅，吸收值降低，最大吸收波长紫移。 l实验部分 1．1仪器与试剂 1．2实验方法在25mL的比色管中依次加入pH为5．0的B．R缓冲溶液3．0mL，夜蓝溶液2．0mL和 RNA标准溶液1．0 光度彳，同时做试剂空白，吸光度值为Ao，并计算吸光度差值△A(Ao-A)。 2结果与讨论 2．1 量的增加而显著降低，且下降程度与加入的RNA的量呈线性关系。 2．2介质种类、缓冲体系和酸度对作用的影响分别用磷酸盐、硼酸盐和伯瑞坦．罗比森(B．R)缓 2．3夜蓝用量和反应时间的影响在同条件下，夜蓝溶液用量为Z0mL时AA最大。将实验溶液 ‘通讯联系人 62 2006年l1月 第四届海峡两岸分析化学学术会议论文集 湖北·武汉 和空白溶液分别在602rim处进行时间扫描，夜蓝与RNA反应瞬间完成，且吸收强度在lh内保持 稳定；而空白溶液吸收强度在20rainI为保持稳定不变，20rain以后吸收强度逐渐减小，其减小程 度变化缓慢，但对实验产生的影响不大，可先放置10min，然后进行测定。 2．4试剂加入顺序和强电解质的影响实验表明试剂加入顺序对体系没有影响。实验证明，体系 的吸收强度差受离子强度的影响很小，离子强度的增加对夜蓝与RNA的结合几乎无影响。表明 在弱酸性介质中质子化的夜蓝与带负电荷RNA不是发生静电吸附作用，而是静电缔合聚集作用。 2．5RNA与夜蓝相互在水溶液中的相行为实验结果表明： (1)RNA与夜蓝是以缔合方式快速 互相作用，阳离子染料夜蓝中和了RNA链上磷酸根的负电荷，减小了RNA链间的斥力，慢速聚集 沉降； (2)随着溶液pH的提高，RNA和夜蓝疏水作用增强，聚集沉降速度加快，说明疏水作用 有利于复合物的形成； 表面活性剂的互相作用相同|9】，RNA表现出表面活性剂性能。 2．6干扰实验当RNA含量4mg／L，相对标准偏差在±5％范围内，研究了下列可能共存的生物大 分子以及Ca斗、Fe、K+等金属离子对体系的影响，它们的最大允许浓度分别为：溶菌酶fO．6 me／L)、 mga0、牛血清蛋白(2．4 DNA(0．72mg／L)、胃蛋白酶(4．4 mg／L)Ca2+(4．8mg／L)Fe3+(3．2mg／L)K+ mol／L