应用DNA微阵列研究斑蝥酸钠诱导K细胞凋亡前后的基因变化.docVIP

2005年中国肿瘤临床年鉴 应用DNA微阵列研究斑蝥酸钠诱导K562细胞凋亡前后的基因变化 宋艳斌 马文丽 冯春琼 郑文岭 南方医科大学基因工程研究所 广州 510515 斑蝥是芫青科昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑蝥的干燥全虫。我国很早就有关于斑蝥能抗肿瘤的记载[1］ 。现代医学研究证明，斑蝥其有效成分是斑蝥素，即斑蝥酸酐，它是斑蝥体内提取的一种单萜类物质，可以抑制癌细胞的核酸代谢及蛋白质的合成，导致癌细胞死亡。但斑蝥素的不良反应较大，主要是泌尿道和消化道反应，使它的临床应用受到极大的限制。近来，人们合成了许多斑蝥素的衍生物，如斑蝥素与铂的络合物、去甲斑蝥素、斑蝥酸钠等［2］ ，以降低斑蝥素的不良反应，增强药物疗效。 我们应用DNA微阵列技术，观察了斑蝥酸钠诱导K562细胞凋亡前后细胞基因表达的改变，初步研究斑蝥钠诱导细胞凋亡的分子机制。 　一、材料和方法 （一）材料 RPMI1640细胞培养基、Super ScriptⅡ反转录酶购自Gibco RBL公司，小牛血清购于四季青公司，噻唑蓝（MTT）购于Sigma公司，二甲基亚砜（DMSO）购于上海生物工程公司，Trizol、DNA聚合酶（Taq酶）购于上海博彩生物工程公司，其它常用酶类购于宝生物工程公司。 2×预杂交溶液:25% 甲酰胺，5×SSC，0.1% SDS;清洗溶液Ⅰ:2×SSC，0.1% SDS;溶液Ⅱ:0.1×SSC，0.1% SDS;溶液Ⅲ:0.1×SSC。Pixsys 5500芯片打印仪购自Cartesian公司，Scan Array Lite芯片扫描仪及其分析软件Quantarray购自Gsi Lumonics公司，玻片及芯片杂交盒购自Corning公司。 艾易舒注射液（0.1mg/10ml即斑蝥酸钠维生素B6注射液），贵州柏强制药有限公司提供，批 　　（二）方法 1. 药物作用浓度的确定 依据静脉滴注药物的血浆峰值浓度公式：C=50×D/5000×2（μg/ml）D指每日的给药量（mg/d）以及艾易舒注射液在临床的使用药量（0.5mg/d），计算出艾易舒注射液的血峰浓度为2.5μg/ml。艾易舒注射液处理的实验组依预实验结果，设立1.25μg/ml;2.5μg/ml和5.0μg/ml三个浓度。 　 2. 细胞培养及处理 人红白血病细胞K562培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，置于37℃，5% CO2 细胞培养箱中，常规培养。每3日换液1次。实验时，以1×104 个细胞/ml接种，在细胞的对数生长期加入药物，使其浓度分别为:处理组（艾易舒注射液）1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml;阴性对照（生理盐水）0μg/ml。 　 3.艾易舒注射液对K562细胞生长的抑制作用 K562细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔接种1ml。细胞处理同前所述。培养20h后，加入MTT溶液，继续培养4h，参照文献［3］的方法，在570nm波长处测定A值。每个浓度接种3个孔，绘制细胞增殖抑制曲线。 　　 4.细胞凋亡的检测 细胞接种于24孔细胞培养板中，如上法加入药物，常规培养后，加入MTT溶液，镜下观察细胞的凋亡情况［4］。同时细胞接种在250ml细胞培养瓶中，培养24h后，提取细胞的DNA［5］ ，1.0%的琼脂糖凝胶电泳，恒压30V/cm。 5．样品制备 K562细胞培养基中加入艾易舒注射液，继续培养4h后，离心收获细胞，参照Trizol试剂盒的方法，提取细胞总RNA。取总RNA 40μg，用Super ScriptⅡ反转录成cDNA第一链，分别用Cy3/Cy5标记对照组/处理组，PCR产物纯化试剂盒纯化后溶于30μl TE中。真空抽干，重溶于5μl水中。分别取出2μl，加入2×杂交缓冲液2μl，95℃5min，14000r/min，离心2min，取出3.5μl用于与微阵列杂交。 　　 6. DNA微阵列探针的收集及芯片制备 常规培养的K562细胞，提取细胞的总RNA，合成cDNA第一链后，用RD技术［3］收集cDNA片段，与T载体连接后转入质粒中保种。PCR扩增插入片段，异丙醇纯化后，调整浓度为600ng/μl，打印芯片。共收集了162个cDNA探针片段，以看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为阳性对照，水稻基因组DNA为阴性对照，50%二甲基亚砜（DMSO）为空白对照，每个探针重复打印3个点，形成30×18的阵列。打印好的芯片经紫外交联（能量为90mJ），80℃干烤2h，避光保存备用。 　 7 .DNA微阵列的杂交检测及数据处理DNA微阵列在42℃杂交18h，取出，分别用清洗溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ洗涤，空气干燥。扫描仪扫描每个探针的荧光强度，用ScanArray软件进行分析，根据以下两个条件作为判断基因差