SDS-PAGE实验剖析.docx

生化实验总结报告 实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量 作者： 田景辉（201306230114） 专业： 生物工程 指导教师： 许培雅 日期： 2015.12.30 组员：杨瑞 徐巧妹 尹彪 程健 刘嘉南 目 录 一、实验介绍……………………………………………………3 二、实验原理……………………………………………………3 三、实验材料、试剂、器皿…………………………………4 四、操作步骤……………………………………………………5 五、注意事项……………………………………………………7六、实验数据记录与处理…………………………………… 7 七、总结与建议……………………………………………… 8 八、术语表………………………………………………………9 九、参考文献………………………………………………… 9 十、附录………………………………………………………9 一、实验介绍 1.实验目的 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。 2.实验背景 在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L (NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。 二、实验原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 生物化学上指在进行SDS（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）中由于凝胶孔径的不连续性（2种孔径）、缓冲液离子成分的不连续性(2种缓冲体系)、PH值（3种PH）和电位梯度的不连续性使得蛋白质分子在浓缩胶和分离胶的界面处浓缩成一条狭小的缝带，成为浓缩效应。 三、实验材料、试剂、器皿 (1).试剂材料： 1、30%丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺（Acr作为单体） 29.2g，甲叉双丙烯酰胺 (Bis作为交联剂）0.8g，溶解于双蒸水100ml，中枢神经毒物凝聚后无毒。 2、10%的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)：0.1mlTEMED+0.9ml双蒸水（凝固加速剂）； 3、10％过硫酸铵溶液（凝固的催化剂）； 4、分离胶缓冲液贮液（1.5mol／L Tris-HCl，pH8.8）； 5、浓缩胶缓冲液贮液（1mol／L Tris-HCl，PH6.8）； 6、2×SDS-样品缓冲液：1ml浓缩胶缓冲液贮液 + 4ml 10%SDS + 1ml疏基乙醇 + 2ml甘油 + 0.5ml 0.1%（w/v）溴酚蓝（电泳指示剂），加双蒸水至10ml。4℃保存； 7、SDS-电极缓冲液贮存液（0.025mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％SDS，pH8.3）：在900ml双蒸水中溶解15.1g Tris和94g甘氨酸，加入50ml 10%（w/v）SDS贮液，加双蒸水补至1000ml则成5×SDS-电极缓冲液； 8、10% SDS：25g SDS用双蒸水溶解至250ml，室温保存； 9、染色液：0.25gR250考马斯亮蓝溶于90ml甲醇∶水（1∶1，v/v）和10ml冰乙酸的混合液 10、脱色液：50ml甲醇加75ml冰乙酸，加蒸馏水至1000ml； 11、蛋白质样品液 12、标准蛋白质：包括兔磷酸化酶B，MW97400；牛血清蛋白，MW66200；兔肌动蛋白， MW43000；牛碳酸酐酶，MrW31000；胰蛋白酶抑制剂，MW20100