实时荧光PCR技术在食品领域的应用.doc

实时荧光PCR技术在食品领域的应用 摘要：随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光PCR技术以其快速、准确定量、便捷等优点，越来越受到人们的重视，不仅在环境监测、医学等领域得到广泛的应用，在食品领域也得到了应用，这大大提高了食品监测水平。本文综述了实时荧光PCR的基本原理及其在国内食品领域中的应用。 关键词：实时荧光PCR；食品监测 1992年Higuchi等在PCR反应过程中加入EB，实现对PCR产物的定量，成为最早的实时PCR．1996年美国Applied Biosystems公司研究出商用实时荧光定量PCR系列，实现了PCR技术的一次飞跃。该技术不仅克服了常规PCR凝胶电泳检测易污染与假阳性率高的缺点，凭借其灵敏度高、特异性强、重复性好、可实现多重反应以及自动化操作等优点，DNA分子，还定量RNA分子，从而进一步定量基因的表达[1]。 实时荧光PCR原理 按照荧光产生的原理，实时荧光PCR可分为非特异性DNA结合染料法和探针法。荧光染料法是在PCR过程中引入荧光染料使之与DNA双链结构结合而发射荧光，荧光信号与被检测样品中DNA含量成正比。荧光探针的设计是实时荧光PCR技术的关键所在．荧光探针的种类很多，目前国内外常用的是Taqman探针、分子信标、杂交探针等。这些探针的检测途径不完全相同，但其基本原理都是根据荧光共振能量转移原理(fluorescence Fesonance energy transfer，FRET)设计的．根据FRET的原理，荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量呈对应关系。实时荧光PCR就是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化实现对起始模板定量及定性的分析。 2 实时荧光PCR技术在食品监测中的应用 聚合酶链式反应技术(PCR)自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物学等领域得到广泛的应用 。特别是实时荧光PCR技术的出现，实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且它采用了完全闭管检测，避免了交叉污染，可实行自动化操作且耗时短，已成为分子生物学研究中的重要工具，亦被应用于食品监测中。该技术从基因水平来检测食品，补充了物理、化学分析方法的不足，能更快捷有效的保障食品安全。 2.1 对转基因食品的检测 随着现代生物技术的发展，转基因食品已逐步进入普通百姓的生活．由于转基因食品所具有的潜在非安全性，建立相应的检测方法是刻不容缓的。目前主要检测转基因作物中特有的启动子35S、终止子NOS、耐除草剂基因EPSPS和抗虫基因CryIA(b)等转基因成分，以确定是否为转基因产品．吴孝槐等[2]采用TaqMan探针技术，对大米中的内源基因蔗糖磷酸合酶SPS和转基因水稻中普遍存在的外源基因CaMV35S启动子、NOS终止子以及苏云金芽孢杆(Bacillusthuringiensis，简写为Bt)杀虫晶体蛋白基因CryIAc进行了实时荧光PCR研究，并对外源基因CrylAc进行了定量检测和敏感性分析。本研究首次实现了利用实时荧光PCR对转基因Bt大米的定性和定量检测。 张舒亚等[3]运用实时荧光PCR方法采用FMV35S启动子、E9 3’终止子、CP4-EPSPS和品系特异性检测引物探针对转基因甜菜中的转基因成分进行了检测，该方法特异性高，灵敏度达到了0.01%，能够应用于进出口甜菜籽的转基因成分检测，为转基因甜菜检测标准的建立提供了依据。 2.2 对掺假食品的检测 在物质需求日益增长的市场经济时代，一些不法商贩为了追求高经济利益昧心作假， “牛肉膏” 假牛肉、鸭肉制成“涮羊肉和烤羊肉”、“假肉丸鱼丸” 等食品掺假事件也屡见报导。如何及时有效地鉴别食品是否掺假已成为食品安全监管和检测机构迫切解决的问题。掺假定量检测技术亟待开发。实时荧光PCR法用于食品成分鉴别时， 在灵敏度、准确性和重复性等重要性能参数上具有无可比拟的优势， 成为该领域的主流技术， 是作为仲裁方法和司法鉴定的理想技术类型， 是现行国家和行业标准中指定的方法之一[4-6]。 周巍等[7]以鸡的cytb基因为目的基因，设计了一套特异性的引物和探针，利用实时荧光PCR方法对鸡精中的鸡源性成分进行定性、定量分析研究。该方法检测的灵敏度为0．002%(w/w) ，检测时间为3 h，为食品中鸡源性成分的检测提供了新方法。 韩建勋等[8]根据梨类甜蛋白基因，设计梨特异性引物，并采用多步异丙醇沉淀的方法富集果汁中的DNA，建立了梨成分的实时荧光PCR检测方法，该方法是首次将分子生物学技术用于梨汁的鉴伪，它避免了品种、产地、收获季节、原料环境