分子生物学与生物化学实验操作设计与技能(7-1)合编.ppt

分子生物学与生物化学实验操作、设计与技能 PCR实验中常见问题 及解决办法 李刚 副教授 标准的PCR反应体系  10×扩增缓冲液 　 10 μl  4种dNTP混合物 　 各200 μmol/L  引物 　　　　 　 各10～100 pmol　  模板DNA 　　　 　0.1～2 μg　 Taq DNA聚合酶 　 2.5 Unit　  Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L  加三蒸水或超纯水至50 μl。  PCR产物的电泳检测时间 　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。  　PCR反应有哪些关键环节？ ①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量；④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。  模板最容易出现的问题 一、模板含有杂质： ①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定,不宜随意更改。 二、模板发生变异： 如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。通常模板发生变异的主要原因是模板切胶回收时间过长（一般应控制在1分钟以内）或无意中将模板置于超净工作台中灭菌所致。  PCR引物常见的问题 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。  DNA聚合酶的问题 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。 需注意的是有时PCR失败是由于忘加了酶。  Mg2+浓度 Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 对于一些难以扩增的模板，建议买PCR Buffer中Mg2+ free的PCR试剂，以便自己通过一些预实验找出PCR反应中最佳的Mg2+浓度。  PCR反应体积 通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。如果不愿重新摸索条件，一个最简单可行的办法是按照小体积的条件多做几管，最后将PCR产物汇集在一起。 退火温度对PCR的影响 退火温度对PCR的扩增来说相当重要，如退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。退火温度可以用引物的Tm值-5度来粗略估计。但是精确的退火温度必须通过预实验来确定（可以使用梯度PCR 仪）。 有时还有必要用标准的温度计（多用电子温度计，带有金属传感器探针）检测一下扩增仪内的温度控制是否准确，这也是PCR失败的原因之一。  PCR出现假阳性的原因？  假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。出现假阳性的原因主要有： （1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 （2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产