瑞香素衍生物对恶性疟原虫体外抗疟活性的研究.pdfVIP

614 以科学发展观促进科技创新(上) 瑞香素衍生物对恶-陛疟原虫体外抗疟活性的研究 黄 芳 汤林华倪奕昌 王琴美 中国疾病预防控制中心寄生虫痛预防控制所，世界卫生组织疟疾、 血吸虫病和丝虫病合作中心，上海市瑞金二路207号，200025 摘要 目的：通过两种抗疟药体外筛选系统筛捡瑞香素类化合物的抗疟活性。方法： TragerJensen法体外培养恶性疟原虫；运用显微镜镜检法和微量荧光法筛选瑞香素抗疟化 各物。结果：DA79和DA78对恶性疟原虫体外有抗疟活性。结论：虽然瑞香素类抗疟化合物 的构效结构还不是很清楚，但本研究将为发现更有效的抗疟化合物提供新的方向。 关键词 医学寄生虫学 瑞香素 抗疟药 药物筛选 疟疾是一种全球性危害人类键康的重要寄生虫病。据统计，全球约有40％的人口遭受疟疾威胁， 每年发病人数2．5亿～3亿．其中死亡人数约2百万。而且，对多种抗疟药具有抗性的恶性疟原虫正迅 速扩散。因此研制并开发新型抗疟药对全球消灭疟疾具有重大的意义。铁螫合剂作为一种新型的抗疟 化合物，其抗疟作用已得到了广泛验证。铁是红内期疟原虫生长所必需的，直接影响DNA合成、能量 代谢、线粒体的功能、电子传递等～系列重要生命活动。我国特产的中草药制品瑞香素(即7，8一二羟 基香豆素)是一种香豆素类衍生物，属于弱铁螫合剂，但是其双羟基香豆素的结构完全不同于氧肟酸盐 类的铁螫合剂。瑞香索作为治疗血管阻塞性疾病的口服药物已经在我国临床应用，证明安全、无明显毒 性。目前研究已发现，瑞香素在体内、体外均具有杀疟原虫裂殪体的活性，体外试验在l—10”mot／L的 剂量范围内瑞香素对恶性疟原虫的杀裂殖体活性与同剂量的氯喹相似，而在感染伯氏疟原虫的小鼠中 瑞香紊灌胃或腹腔注射均与氯喹灌胃有相似的抗疟效果。因此，以瑞香素为先导化合物通过对瑞香素 核心结构的修饰，保留其铁螯台基团，提高其特异性的抗疟作用，研制出高效低毒的抗疟新药有重要的 应用价值。本研究就是通过两种抗疟药体外筛选系统筛检瑞香素类化合物的抗疟活性。 一、材料与方法 (一)药物 瑞香素由吉林西点制药长生产。21种瑞香素衍生物由国家新药中心协助合成。 (二)恶性疟原虫的培养 按TragerJensen法建立恶性疟原虫(Plasmodium 的疟原虫培养基为含25raMHEPES、23．8mM 生长稳定后，用5％甘露醇进行同步化处理，一个周期后(约48h)再次用甘露醇处理，同步化后继续培 养．至生长为成熟裂殖体期。对于传统显微镜镜检法，调整最终的红细胞比窑为5％，原虫血症为3％： 而对于微量荧光法，需用正常“O”型红细胞和完全培养基稀释使最终红细胞比容为2％．原虫血症为 驭科学发展观促进科技创新(三) 615 1％。 (三)显微镜镜捡法 将原虫培养物调整至3％原虫血症·红细胞比容为5％，按照200tzL每孔分装入96孔板a瑞香索及 其衍生物按不同浓度分别加入小孔，在二氧化碳培养箱中培养24h后，取每孔中的培养物涂薄血片，吉 姆萨染色后显微镜观察原虫血症的变化。 (四)微量荧光法 同步化培养恶性疟原虫至环状体期，调整至1％原虫血症，红细胞比容为2％，按照150#L每孔分装 入96孔板，瑞香素及其衍生物援不同浓度分别加入4qL，在二氧化碳培养箱中培养a8h后，再每孔加入 mM Probes，USA)、10Tris 50FtL荧光混合物为PicoGreen(0．25,uL，TE缓冲液稀释200倍)(Molecular mM —HCI、1 EDTA，pH x一100。暗室内培养20mlrt，用荧光分光光度 7．5{TE缓冲液)及2％Triton 计在激发光谱为485 ilm、发射光谱为528nm处测定其荧光强度。 (五)数据分析 Microso{t Excel