MALDI-TOF-MS技术及应用.pptxVIP

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术 2002年诺贝尔化学奖 发展了对生物大分子进行鉴定和结构分析的方法，建立了软解析电离法对生物大分子进行质谱分析 田中耕一【日】 约翰·贝内特·芬恩【美】 MALDI技术 离子化技术：MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization MALDI技术的原理 样品与基质，在样品靶表面形成的共结晶薄膜 激光照射，基质吸收能量 基质把能量传递给样品分子，将电荷转移给样品，样品电离。 质谱分析原理 进样系统 离子源 质量分析器 检测器 1.气体扩散 2.直接进样 3.色谱 1.电子轰击 2.化学电离 3.场致电离 4.激光 1.单聚焦 2.双聚焦 3.飞行时间 4.四极杆 基质辅助激光解吸电离(MALDI) 基本原理： 将样品分散在基质分子中并形成共结晶后直接进样, 当用激光(337 nm的氮激光或355 nm的固体激光器)照射晶体时, 基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。因此基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品分子带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子。 离子源特点: 1、使用脉冲式激光； 2、产生单电荷离子和部分双单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数有一一对应关系； 3、离子化效率高，灵敏度高 (fmol～amol) 常用基质： 芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)（SA)、龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸)(DHB)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、吡啶甲酸(PA)、3-羟基吡啶甲酸(3HPA)。 MALDI技术中基质的作用 把样品分子彼此分开(基质：样品=10，000：1)，削弱样品分子之间的相互作用。 基质吸收激光的能量，并将部分能量传递给样品。 帮助样品离子化。 基质是如何帮助样品分子电离的？ 以正离子模式为例： ? 基质吸收激光的紫外波长后增加能量，並将能量部分释放给样品分子 ? 帮助样品分子质子化，並帶有电荷（M+H+） ? [M+H]+ 在真空状态下，雾化形成气态单一分子。在高压电场的吸引下[M+H]+ 离开离子源飞向飞行管 常用基质及选择 基质 样品 HCCA 蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物 DHB 蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物 HPA 核苷酸 Dithranol 非极性聚合物 IAA 非极性聚合物 E=U·z=1/2mv2 和 t=L/V E：离子在加速电场获得的动能; U：加速电场电压 z：离子所带电荷; m：离子质量 v：离子飞行速度; L：飞行管道长度 t：离子飞行时间; c：常数 质量分析范围：500Da---100KDa MALDI-TOF质谱的原理 t = c · m/z Pulsed laser 多肽离子在TOF管里飞行，飞行速度取决于多肽离子的M/Z的大小 Flight tube 1：基质与多肽样本共同 置于刚靶上。 High vacuum High voltage 2. 样本被激光电离形成多肽 离子混合物 。 20 - 25 kV 5. 检测到每个离子的M/Z后，同一张图谱上计算机输出每个肽段M/Z，即蛋白质的多肽图谱，通过与理论数据库中的肽图片比对，从而鉴定蛋白。 4. 到达检测器的离子，通过检测器检测出每个肽段离子的M/Z. 1.3 MALDI-TOF-MS质谱的分析步骤 Laser MALDI-TOF-MS 线性模式检测 Sampleplate Acceleration grids Drift tube Ion detector Mass spectrum Vacuum system Vacuumlock 几秒钟即可得到结果 MALDI-TOF 质谱的特点 ? 软电离质谱－碎片少 ? 检测质量范围宽400kDa ? 灵敏度高－ fmol ? 分析速度快－自动化 ? 数据容易解释 ? 可以测试混合物 ? 可以测试高分子 ? 仪器容易使用、维护 MALDI TOF MS的构成 检测器1：线性模式 检测器2：反射模式 线性模式和反射模式 反射模式（linear） 一般测试分子量小于4000的样品 分辨率高，单同位素清晰准确 线性模式（reflection） 一般测试大分子量样品（M4000） 分辨率低，得到是平均分子量的质荷比 反射模式下TOF的分辨率高于线性模式 Bruker公司仪器示意图 ABI公司仪器示意图 岛津公司仪器示意图 Detector Helium collision cell for