仪器分析选论16.5.2酶免疫分析技术精要.pptx

16.5.2酶免疫分析技术 应化1305 宋宇韡 33 2 酶免疫技术的分类 克隆酶供体免疫测定 酶免疫分析技术 酶免疫组织化学技术 酶免疫测定技术 均相酶免疫测定 异相酶免疫测定 酶放大免疫测定技术 液相酶免疫测定 固相酶免疫测定： 酶联免疫吸附试验(ELISA) 组织切片或其它标本中抗原的定位分析 液体标本中抗原或 抗体的定性和定量 一、均相酶免疫测定法 酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。 未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离标记物。 与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合标记物。 一、均相酶免疫测定法 基本原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，其中的酶活性将发生改变。 因此，不需对反应液中结合和游离的酶标记物进行分离，直接测定反应系统中总酶活性的变化即可推算出被测样品中抗原的含量。 二、非均相酶免疫测定法 基本原理：抗原抗体反应平衡后，需采用适当的方法分离游离的和结合的酶标记物，然后对经酶催化的底物显色程度进行测定，再推算待测样品中抗原（或抗体）的含量。依据测定方法又可分为液相和固相酶免疫测定。目前临床上多用固相酶免疫测定法。 酶联免疫吸附试验（ELISA） 一、基本原理 底物显色 定性或定量的分析 包被 将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面 反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体 洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离 1 2 3 4 方法类型及反应原理 （一）检测抗原的方法 将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。 1.双抗体夹心法 双抗体夹心法检测抗原 适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原 （1）将已知抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的 定性或定量。 2．技术要点 底物 （+） 双抗体夹心法测抗原 2.双位点一步法检测抗原 即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。 双位点一步法检测抗原 在包被时使用一种单抗，酶标记时使用一种单抗 E E E E （+） E E （-） 双位点一步法测抗原 如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成“钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。 注意事项 E 底物 固相抗体 标本（抗原浓度高） 酶标抗体 3.竞争法检测抗原 酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中待检抗原含量呈反比。待检抗原量越多，酶标抗原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含量呈反比。 酶标抗原 竞争法检测抗原 （1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。 （3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 技术要点 竞争法测抗原 （二）检测抗体的方法 将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。 1.间接法 间接法检测抗体 酶标二抗是针对一类免疫球蛋白(如抗人IgG），因此该法只需要变换固相抗原，即可用一种酶标二抗测各种与抗原相应的抗体，具有更广的通用性 间接法测抗体 2.双抗原夹心法 将已知抗原包被固相载体，待检标本中的相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。 同双抗体夹心法。 技术要点 双抗原夹心法检测抗体 双抗原夹心法测抗体 3.竞争法检测抗体 同竞争法结合抗原。 HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。 1．原理 （1）竞争法检测HBcAb： ①将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。 ②加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。 ③加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标